郭 樂，申元英,2*

（1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000;2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

有研究表明，磷是水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要限制因子〔1〕。水環(huán)境中的磷主要來自生活污水、工業(yè)廢水和農(nóng)業(yè)排水。人體代謝廢物、含磷合成洗滌劑的大量使用，化肥、農(nóng)藥、水處理的廢水含磷量均較高。廢水經(jīng)生化處理后，剩余的大部分磷隨排水進(jìn)入河道，這是城市附近河道中磷的主要來源〔2〕。農(nóng)田中使用的磷肥，除被植物吸收利用的部分外，其余的相當(dāng)部分通過雨水沖入水體。家畜家禽的廢棄物及排泄物中的大量有機(jī)磷，隨著雨水的沖刷進(jìn)入水體。水體中磷逐漸增多，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化。近年來研究〔3-4〕發(fā)現(xiàn)，微生物也是控制和影響磷釋放的重要因素，可直接參與水體中磷的循環(huán)，把不溶的有機(jī)磷化合物轉(zhuǎn)化為可溶性磷，并可固定大量的磷在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)〔5〕。本次研究從污水中分離純化得到能夠降解有機(jī)磷的細(xì)菌，篩選高效的有機(jī)磷降解菌，研究其解磷能力，為污水中的生物除磷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集污水處理廠濃縮池水樣，裝入250 mL滅菌采樣瓶中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 試驗(yàn)所需微生物培養(yǎng)基如下：

（1）富集培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，為了使解有機(jī)磷細(xì)菌在培養(yǎng)基中形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，在培養(yǎng)基中加入適量卵黃液。

（2）有機(jī)磷固體培養(yǎng)基〔6〕：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min）冷卻至50℃以下，立即加入60 mL卵黃稀釋液，倒平板。其中，卵黃稀釋液的制備〔7〕：用75%酒精擦拭雞蛋外殼，敲破雞蛋一端，流去蛋清后將蛋黃流入已滅菌的錐形瓶中，按1：1比例加入無菌生理鹽水，搖勻。

（3）蒙金娜培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

（4）有機(jī)磷液體培養(yǎng)基〔7〕：向1000 mL蒙金娜培養(yǎng)基中加入0.4 g酵母膏，再加入0.2 g用無水乙醇溶解過濾的卵磷脂。

1.2.2 解有機(jī)磷細(xì)菌的分離及純化 用無菌移液管吸取5 mL水樣加入到裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30℃、130 r/min的恒溫水浴搖床上富集培養(yǎng)5 d。

常規(guī)10倍稀釋法稀釋樣品，分別從各個(gè)濃度的菌懸液中吸取0.1 mL，用涂布棒均勻涂布在有機(jī)磷固體平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，以大腸埃希菌作為陰性對(duì)照。于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，能產(chǎn)生透明溶磷圈的即為解有機(jī)磷細(xì)菌。挑取有機(jī)磷細(xì)菌，分區(qū)劃線接種在有機(jī)磷固體平板上進(jìn)行純化，將純化后的細(xì)菌接種在斜面培養(yǎng)基中，4℃冰箱保種。

1.2.3 解有機(jī)磷細(xì)菌的篩選及解磷能力測(cè)定 有機(jī)磷固體平板解磷能力測(cè)定〔8〕：將分離純化后的菌株分別用接種針點(diǎn)接種在有機(jī)磷固體平板上，培養(yǎng)10 d，觀察溶磷圈的大小，分別測(cè)量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計(jì)算D/d的比值。

有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中解磷能力測(cè)定：分別將菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30℃、130 r/min，水浴恒溫?fù)u床上搖18 h，得到菌懸液。將1 mL的菌懸液轉(zhuǎn)移至裝有50 mL滅菌的蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，于30℃、130 r/min的水浴恒溫?fù)u床上培養(yǎng)7 d，采用過硫酸鉀-鉬銻抗分光光度法〔9〕連續(xù)7 d監(jiān)測(cè)水樣中水溶性磷含量。

2 結(jié)果

2.1 解有機(jī)磷細(xì)菌的分離純化 從污水處理廠濃縮池采集的水樣，通過富集培養(yǎng)后，得到解有機(jī)磷細(xì)菌共19株。將平板上產(chǎn)生溶磷圈的解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)過多次的分離純化，在分離純化過程中，其中的5株喪失解磷能力，最終得到具有降解卵磷脂能力的細(xì)菌共14株。

2.2 平板法測(cè)定菌株解磷能力及優(yōu)勢(shì)菌株的篩選將獲得的14株解有機(jī)磷細(xì)菌分別用接種針點(diǎn)接種于單個(gè)的有機(jī)磷平板上（90 mm平板），在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。觀察并測(cè)量溶磷圈大小及菌落大小，篩選其中溶磷圈較大的4株細(xì)菌做后續(xù)定量測(cè)定，見表1、圖1。

表1 平板法測(cè)定解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力

圖1 OPB8、OPB15菌株溶磷圈的測(cè)定

由表1可以看出，通過10 d的培養(yǎng)，篩選出4株解磷能力強(qiáng)的菌株。其中OPB8菌株的溶磷圈最大，而其溶磷圈直徑與菌落大小直徑比例較小，OPB15號(hào)菌株溶磷圈稍小，但其比例最大。OPB17、OPB19解磷能力次之。上述4株細(xì)菌的在平板上的產(chǎn)生的溶磷圈大小均大于其余菌株，根據(jù)溶磷圈大小，只能初步測(cè)定解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力，為了了解其分解有機(jī)磷的趨勢(shì)，本試驗(yàn)采用液體培養(yǎng)法對(duì)其解磷能力進(jìn)行了測(cè)定。

2.3 液體培養(yǎng)法測(cè)定解磷能力 由表2可見，連續(xù)7 d的監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中水溶性磷含量，OPB17、OPB19菌株達(dá)到解磷峰值時(shí)，培養(yǎng)液中的水溶性磷含量達(dá)到8.11 mg/L和9.17 mg/L，解磷率分別為107.9%和135.1%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的水溶性磷含量降至6.52 mg/L、5.46 mg/L，但均比原培養(yǎng)液中的水溶性磷含量多。OPB15、OPB19菌株達(dá)到解磷峰值時(shí)，培養(yǎng)液中的水溶性磷含量達(dá)到5.14 mg/L和13.62 mg/L，解磷率分別為31.8%、249.2%。但7 d培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液中的水溶性磷含量降至1.43 mg/L和0.58 mg/L。使培養(yǎng)液中的水溶性磷含量分別降低了72.2%和95.7%。

表2 解有機(jī)磷細(xì)菌解磷能力（7 d）

2.4 解有機(jī)磷細(xì)菌解磷曲線 如圖2所示，篩選出的4株解有機(jī)磷細(xì)菌對(duì)卵磷脂中磷的釋放高峰在第3～4天，隨后水溶性磷含量逐漸下降，這可能是菌體利用了分解出的無機(jī)磷。

圖24株細(xì)菌解磷曲線

3 結(jié)論

從以上結(jié)果可以看出，從污水中分離出能夠降解有機(jī)磷的細(xì)菌的解磷能力不同，其培養(yǎng)液中水溶性磷含量均表現(xiàn)為先升高后降低，說明這些菌株不但有分解有機(jī)磷的能力，還具有吸收、利用和儲(chǔ)存磷的能力。

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)分離純化篩選的4株細(xì)菌菌落直徑均較大，可能與培養(yǎng)基中含有充足的卵磷脂有關(guān)。OPB8菌株的溶磷圈最大，但在液體培養(yǎng)基中的解磷能力降低，OPB19菌株的溶磷圈最小，但在液體培養(yǎng)基中的解磷能力最大，這可能與細(xì)菌分泌的解磷酶與有機(jī)磷的接觸及培養(yǎng)條件有關(guān)〔10〕。趙小蓉等〔11〕認(rèn)為，解有機(jī)磷細(xì)菌在分解化合物時(shí)，一部分磷被同化為細(xì)菌自身的有機(jī)磷，另一部分以磷酸鹽狀態(tài)儲(chǔ)存在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。另有報(bào)道〔12〕指出，細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá)靜止期后，能吸收環(huán)境中的磷，以多聚磷酸鹽的形式（異染顆粒）儲(chǔ)存在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。本次實(shí)驗(yàn)中，4株解有機(jī)磷細(xì)菌的培養(yǎng)液中水溶性磷含量均有下降，可能與細(xì)菌生長(zhǎng)利用了培養(yǎng)液中水溶性磷有關(guān)。本次試驗(yàn)為進(jìn)一步研究解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷機(jī)制及模擬實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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