周 薇 薇，尹 亞 輝，趙 長(zhǎng) 新

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

木聚糖(xylan)是自然界中含量?jī)H次于纖維素的可再生生物資源。木聚糖酶(xylanase)是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱，它可以將木聚糖降為寡聚木糖、木糖和少量單糖[1－2]。國(guó)內(nèi)在木聚糖酶方面的研究起步較晚，迄今為止，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道對(duì)木聚糖酶的研究基本上還僅限于對(duì)產(chǎn)木聚糖酶天然優(yōu)良菌株的篩選、酶的純化和一些酶學(xué)性質(zhì)研究方面，只克隆了少數(shù)木聚糖酶基因。我國(guó)每年都會(huì)生產(chǎn)大量農(nóng)業(yè)腳料，如玉米芯、稻殼、秸稈等，絕大部分因難以利用僅作為農(nóng)家燃料。這些物質(zhì)中都含有大量的木聚糖，若利用木聚糖酶將其轉(zhuǎn)化為低聚木糖，既可處理農(nóng)業(yè)廢料，變廢為寶，保護(hù)環(huán)境，又可促進(jìn)我國(guó)低聚糖工業(yè)的發(fā)展，因此對(duì)木聚糖酶制劑的研究將具有十分可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[3－5]。本試驗(yàn)利用農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵基質(zhì)，對(duì)黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了探討，其結(jié)果可為木聚糖酶的開發(fā)和研制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑曲霉(AspergillusnigerFIP－09－24)，大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏所；菌種保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：麩皮與水按質(zhì)量比1∶1拌勻，pH自然；基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮12.5g、大麥渣12.5g、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、吐溫80體積分?jǐn)?shù)0.15%、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、水體積分?jǐn)?shù)50%，pH自然。

種子培養(yǎng)：挑取3環(huán)菌苔，接入種子麩曲培養(yǎng)基中，混勻后在28℃培養(yǎng)72h后備用。

發(fā)酵產(chǎn)酶：將種子按接種量3%接入產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 酶活力的測(cè)定

稱取2g粉碎后的固態(tài)發(fā)酵物，轉(zhuǎn)移到50mL的磷酸緩沖液(0.02mol／L、pH 6.5)中，4℃抽提12h后用漏斗過濾，濾液即為所需酶液，測(cè)定木聚糖酶活力[6]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

研究碳源(麩皮與大麥渣的比例)、含水量、氮源與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響顯著因素碳源、含水量、氮源，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，去掉原有碳源，分別加入按如下質(zhì)量比為1∶1、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的麩皮與大麥渣，并保證總質(zhì)量為25g，28℃培養(yǎng)72h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of proportion of bran and barleycorn on xylanase production

由圖1可知，當(dāng)麩皮與大麥渣按質(zhì)量比4∶1配制培養(yǎng)基時(shí)，木聚糖酶酶活達(dá)到最高為48 842U／g，因此最佳產(chǎn)酶麩皮與大麥渣之比為4∶1。這是因?yàn)辂熎ぶ懈缓嗵?、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等常用的培養(yǎng)基成分，它既是碳源又是氮源，還含有某些對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶起促進(jìn)作用的因子。但麩皮過多，培養(yǎng)基黏性增大，不利于透氣，影響生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量；而大麥渣含有豐富的木聚糖，又能增加培養(yǎng)基孔隙，但大麥渣過多，菌絲生長(zhǎng)慢，酶活低。

2.1.2 含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在麩皮與大麥渣比例為4∶1的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，去掉原有水分，分別加入50%、55%、60%、65%、70%的蒸餾水。28℃培養(yǎng)72h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of water on xylanase production

由圖2可知，含水量為55%時(shí)，木聚糖酶酶活達(dá)到最高為52 352U／g。這是因?yàn)樗值母叩蜁?huì)影響到基質(zhì)的透氣性和菌絲生長(zhǎng)狀況，也會(huì)影響到代謝活動(dòng)和目的產(chǎn)物的合成。高于最佳水分含量，將使麩皮的透氣性降低，氧氣輸送量減少；而低于最佳水分含量將導(dǎo)致固態(tài)底物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可溶性下降，而微生物也得不到足夠的水分進(jìn)行生長(zhǎng)產(chǎn)酶。

2.1.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，在麩皮與大麥渣比例為4∶1、含水量為55%的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，去掉原有氮源，分別加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的硫酸銨。28℃培養(yǎng)72h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on xylanase production

由圖3可知，含氮量為2.0%時(shí)，木聚糖酶酶活達(dá)到最高為52 460U／g。這是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能良好生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時(shí)不能滿足微生物正常生長(zhǎng)所需，濃度過高則對(duì)微生物生長(zhǎng)起抑制作用。本試驗(yàn)中采用的硫酸銨屬于無機(jī)鹽，而適量的無機(jī)鹽能維持和促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，過量反而會(huì)起到抑制或殺菌作用。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將麩曲種子按照3.0%的接種量接種到經(jīng)優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of culture time on xylanase production

由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間為60h時(shí)，木聚糖酶酶活達(dá)到最高為65 888U／g，因此最佳產(chǎn)酶時(shí)間為60h。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，抑制了酶活性，所以培養(yǎng)時(shí)間以60h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果所確定的最佳反應(yīng)條件，采用二次回歸通用旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)(三因素三水平)試驗(yàn)，其中三因素包括含水量(X1)、麩皮與大麥渣質(zhì)量比(X2)和氮源含量(X3)，考察木聚糖酶酶活力，因素和水平取值見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶影響因素響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

利用Minitab 15軟件對(duì)以上各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得出回歸模型方程為

該方程表明木聚糖酶酶活與所選的3個(gè)因素之間的線性關(guān)系顯著，即試驗(yàn)方法可靠?；貧w方程的平方項(xiàng)系數(shù)都較大，說明響應(yīng)值與試驗(yàn)因子之間的關(guān)系并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；而一次項(xiàng)和交互項(xiàng)系數(shù)較小，說明響應(yīng)面分析所選3個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，驗(yàn)證回歸模型，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3、4。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of RSM analysis

表3 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值Tab.3 The value of regression coefficient in regression equation

從表3和4中可以看出，X1X1、X3X3對(duì)木聚糖酶的酶活有顯著影響，X2X2對(duì)木聚糖酶酶活的影響是極顯著的，說明響應(yīng)值與試驗(yàn)因子之間的關(guān)系并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P＞0.05表明該方程可以接受?？梢岳迷摶貧w方程確定最優(yōu)的產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基成分。

運(yùn)用Minitab 15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出曲面圖，結(jié)果如圖5～7所示。

表4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析Tab.4 Result analysis of Box－Behnken experiments

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

響應(yīng)值(Y)最大值時(shí)的各因子水平為：X1＝0.136，X2＝－0.089，X3＝0.025，轉(zhuǎn)換后得到最佳培養(yǎng)基配方為：含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.7%、麩皮與大麥渣之比為3.8∶1、含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，預(yù)測(cè)所得酶活為65 943U／g。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到木聚糖酶活性為66 002U／g，與模型預(yù)測(cè)值相差0.1%，與理論值基本相符。

3 結(jié) 論

討論了不同條件對(duì)黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，確定了最優(yōu)發(fā)酵條件組合為：麩皮與大麥渣質(zhì)量比為3.8∶1、含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)55.7%、含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%。并在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的木聚糖酶活性為66 002U／g，與模型預(yù)測(cè)值相差0.1%，可見該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。在響應(yīng)面法確定的最佳發(fā)酵條件下，菌體所產(chǎn)酶活較之單因素條件下所產(chǎn)酶的活性提高了114U／g。

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