張 玉 良，田 晶，徐 龍 權(quán)，于 淼

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連美羅大藥廠，遼寧 大連 116036)

0 引 言

常用的β－葡聚糖提取方法包括化學(xué)法和物理法，這些方法往往會(huì)溶解掉部分可溶性纖維，而可溶性纖維卻是膳食纖維中起重要生理功能的部分[1]。應(yīng)用生物技術(shù)方法可以有效提取水溶性β－葡聚糖，通過(guò)啤酒酵母、酒精酵母、黃酒酵母和釀酒酵母發(fā)酵來(lái)提取燕麥麩中的β－葡聚糖均能使提取率提高[2]。黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生多種活性很高的酶系，如淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等[3]，可利用黑曲霉的這些性質(zhì)，在發(fā)酵燕麥麩的過(guò)程中有效去除果膠、淀粉等雜質(zhì)，從而提高β－葡聚糖純度。目前尚未見(jiàn)黑曲霉發(fā)酵法提取燕麥麩中β－葡聚糖的報(bào)道。本研究嘗試采用具有淀粉酶、果膠酶等豐富酶系的黑曲霉發(fā)酵的方法來(lái)提取燕麥麩中的β－葡聚糖。

1 材料與方法

1.1 主要材料、菌種、培養(yǎng)基

燕麥麩，大連醫(yī)諾生物有限公司提供；黑曲霉(Aspergillusniger)sp.48s，由大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏所提供；察氏培養(yǎng)基，0.1MPa滅菌15min。

1.2 方 法

1.2.1 黑曲霉種子液的制備

將斜面上的黑曲霉菌體用接菌環(huán)接于液體培養(yǎng)基中，充分搖勻后放入水浴恒溫?fù)u床中30℃、160r／min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 燕麥麩固體發(fā)酵方法

取燕麥麩20g于250mL錐形瓶中，滅菌后倒入種子液，攪拌均勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔2h搖瓶一次。在發(fā)酵過(guò)程中，首先對(duì)黑曲霉的菌齡、接種量、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間等條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定燕麥麩中β－葡聚糖的最佳提取工藝。

1.2.3 燕麥麩中β－葡聚糖的提取

將發(fā)酵后的燕麥麩在200mL pH 10的堿液80℃下浸提2h，離心后用95%乙醇醇析，干燥，得到β－葡聚糖產(chǎn)品。對(duì)在最佳條件下得到的β－葡聚糖進(jìn)行二次醇析。

1.2.4 剛果紅法檢測(cè)β－葡聚糖含量

稱取0.2g產(chǎn)品倒入40mL去離子水中，加熱充分溶解，4 000r／min離心20min；取上清液5mL稀釋600倍，從稀釋液中取6mL于比色管中，加入4mL剛果紅顯色，反應(yīng)30min，于紫外分光光度計(jì)550nm下檢測(cè)吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)品純度。

提取率＝β－葡聚糖產(chǎn)品質(zhì)量／原料總質(zhì)量

純度＝產(chǎn)品中β－葡聚糖的質(zhì)量／產(chǎn)品總質(zhì)量

1.2.5 瓊脂糖凝膠柱層析法測(cè)定β－葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量

通過(guò)對(duì) Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)品 T－70、T－500、T－2000及β－葡聚糖產(chǎn)品進(jìn)行凝膠色譜分析，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出β－葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 β－葡聚糖黏度的測(cè)定

根據(jù)GB 10247—1988采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定β－葡聚糖水溶液的黏度。將β－葡聚糖溶解后稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，以去離子水作為參照樣，分別測(cè)量30、40、50、60、70、80℃試驗(yàn)所得產(chǎn)品及市售產(chǎn)品水溶液的黏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子液菌齡對(duì)產(chǎn)品純度的影響

在菌體轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基時(shí)起，分別從種子液中取生長(zhǎng)時(shí)間為7、10、13、17、20h的種子液20mL，接入20g燕麥麩進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間17h，考察種子液菌齡對(duì)產(chǎn)品純度的影響，結(jié)果如表1所示。種子液菌齡在10h時(shí)產(chǎn)品純度最高，因此將種子液菌齡定為10h。

表1 種子液菌齡對(duì)產(chǎn)品純度的影響Tab.1 Effect of Aspergillus niger age on purity of product

2.2 接菌量對(duì)產(chǎn)品純度的影響

分別選取5、10、15、20、25mL種子液對(duì)燕麥麩進(jìn)行發(fā)酵，考察接菌量對(duì)產(chǎn)品純度的影響，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯?dāng)接菌量較少時(shí)β－葡聚糖的純度極低，說(shuō)明當(dāng)接菌量過(guò)少，菌體產(chǎn)酶不足，無(wú)法充分發(fā)酵燕麥麩，導(dǎo)致產(chǎn)品純度低；當(dāng)接菌量增加到15mL時(shí)，β－葡聚糖的純度有顯著提高；加大接菌量后，β－葡聚糖的純度沒(méi)有進(jìn)一步提高，反而略有下降。因此，15mL為最適接菌量。

表2 接菌量對(duì)產(chǎn)品純度的影響Tab.2 Effect of volume of seed－liquid on purity of product

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品純度的影響

分別在20、25、30、35、40℃發(fā)酵燕麥麩17h，考察發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品純度的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，黑曲霉在30℃時(shí)發(fā)酵燕麥麩得到的β－葡聚糖產(chǎn)品純度最高，為43.99%。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品純度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on purity of product

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品純度的影響

在種子液菌齡10h、用菌量為15mL、發(fā)酵溫度30℃條件下考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品純度的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品的純度提高，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)10h為最高，繼續(xù)加長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，產(chǎn)品純度降低。這說(shuō)明當(dāng)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)超過(guò)10h，黑曲霉中果膠酶、淀粉酶等酶活力降低，除雜效果不佳。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品純度的影響Fig.2 Effect of fermentation period on purity of product

2.5 正交試驗(yàn)確定發(fā)酵條件

通過(guò)以上試驗(yàn)可以看出，種子液的菌齡、接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等條件都對(duì)發(fā)酵結(jié)果有較大影響，因此做多因素水平的正交試驗(yàn)來(lái)確定最佳試驗(yàn)條件，結(jié)果如表3、表4所示。發(fā)酵因素的主次關(guān)系依次為種子液菌齡、用菌量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度，其中發(fā)酵溫度的影響因素最小。最適發(fā)酵條件為：種子液菌齡10h，發(fā)酵時(shí)間10h，發(fā)酵溫度30℃，用菌量15mL。

表3 正交試驗(yàn)水平因素表Tab.3 Factor and level table of orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)條件與結(jié)果表Tab.4 Conditions and results of orthogonal experiment

2.6 提取條件的驗(yàn)證

將20g燕麥麩接入15mL種子液(種子液的菌齡為10h)，30℃發(fā)酵10h，提取到的產(chǎn)品采用剛果紅法檢測(cè)，經(jīng)二次醇析后，β－葡聚糖提取率為6.28%，純度為52.53%。

2.7 β－葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量以及黏度的測(cè)定

2.7.1 相對(duì)分子質(zhì)量

相對(duì)分子質(zhì)量是β－葡聚糖的一個(gè)重要特性，直接影響β－葡聚糖的溶解性、黏度及其生理活性。根據(jù)“1.2.5”中所述方法，由線性回歸方程y＝－0.019 2x＋7.710 4計(jì)算出本產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106。該結(jié)果與Wood等[4]報(bào)道的β－葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量3.0×106較接近，而Bhatty等[5]報(bào)道的結(jié)果為2.0×106。綜合近年來(lái)的報(bào)道，由于提取方法、提取條件以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法的不同，得到β－葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍也不盡相同。

2.7.2 黏 度

考察溫度對(duì)β－葡聚糖溶液黏度的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3看出，隨著溫度的升高，β－葡聚糖的黏度降低。產(chǎn)品黏度水平與市售燕麥麩中提取的β－葡聚糖相當(dāng)。說(shuō)明采用黑曲霉固體發(fā)酵法提取到的β－葡聚糖具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 溫度對(duì)β－葡聚糖溶液黏度的影響Fig.3 Effect of temperature on viscosity ofβ－glucan

3 結(jié) 論

采用黑曲霉發(fā)酵燕麥麩提取β－葡聚糖，可得到較高純度水溶性膳食纖維，最佳提取條件為：種子液菌齡10h，用菌量15mL，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間10h。所得燕麥麩中β－葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106，提取率為6.28%，純度為52.53%，產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

[1]章海燕，張暉，王立，等.燕麥β－葡聚糖的研究進(jìn)展[J].糧食與食品工業(yè)，2009，16(6)：8－12.

[2]潘妍，何聰芬，韓揚(yáng)，等.發(fā)酵法提取燕麥β－葡聚糖的初步探索[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(4)：116－118.

[3]王宜雷.微生物學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：39－44.

[4]WOOD P J，WEISZ J，BLACKWELL B A.Molecular characterization of cereal beta－D－glucans.Structural analysis of oat beta－D－glucan and rapid structural evaluation of beta－D－glucans from different sources by high－performance liquid chromatography of oligosaccharides released by lichenase[J].Cereal Chemistry，1991，68：31－39.

[5]BHATTY R S.Laboratory and pilot plant extraction and purification ofβ－glucan from hulless barley and oat brans[J].Journal of Cereal Science，1995，22：163－170.