楊 利 偉，許 兆 濱，張 春 枝，楊 希，畢 妍

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧 大連 116113)

0 引 言

類(lèi)胡蘿卜素(carotenoids)是一種天然產(chǎn)物的總稱(chēng)。迄今為止，人類(lèi)在自然界中已發(fā)現(xiàn)600多種天然的類(lèi)胡蘿卜素[1]。天然類(lèi)胡蘿卜素主要存在于高等植物中，在藻類(lèi)、微生物和海洋軟體動(dòng)物殼體內(nèi)也有分布。目前類(lèi)胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成、天然提取和微生物發(fā)酵[2]。類(lèi)胡蘿卜素在食品、飼料、醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。類(lèi)胡蘿卜素在防癌、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)細(xì)胞免受損傷、增強(qiáng)肌肉耐力等方面都有特殊的貢獻(xiàn)[3－5]。

海參卵(sea cucumber ovum)，俗稱(chēng)海參花，是海參加工過(guò)程中的副產(chǎn)物。海參卵和海參體壁有著同樣豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如多糖、核酸、性腺色素等[6]。近年來(lái)中國(guó)海參產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，而海參卵的回收利用一直被人們所忽視，對(duì)其中應(yīng)用價(jià)值巨大的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)的提取分析意義重大。本實(shí)驗(yàn)以海參加工副產(chǎn)物海參卵為原料，提取其中的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)，結(jié)合現(xiàn)代分析方法，優(yōu)化了提取條件，為海參卵的綜合利用及類(lèi)胡蘿卜素的深入研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

海參卵，大連棒棰島海產(chǎn)企業(yè)集團(tuán)有限公司；乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)。

1.2 儀 器

722S分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL－16G)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；恒溫水浴鍋(HS－3001)，太倉(cāng)市科教儀器廠(chǎng)；干燥箱(766－3型遠(yuǎn)紅外)，上海三星電熱儀器廠(chǎng)。

1.3 方 法

1.3.1 原料含水量測(cè)定

稱(chēng)取凍鮮海參腸卵10g放入105℃恒重的玻璃皿中，105℃烘干至恒重，減重法測(cè)定。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為

式中：w(水)為水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m1為稱(chēng)量瓶和試樣質(zhì)量，g；m2為稱(chēng)量瓶和試樣干燥后質(zhì)量，g；m3為稱(chēng)量瓶的質(zhì)量，g。

1.3.2 類(lèi)胡蘿卜素的提取

類(lèi)胡蘿卜素屬于脂溶性色素，可采用有機(jī)溶劑浸提法，不同結(jié)構(gòu)的類(lèi)胡蘿卜素要使用不同的溶劑進(jìn)行萃取[7]。稱(chēng)取一定量的原料，按比例加入提取溶劑，在恒溫下浸提一定時(shí)間，離心得類(lèi)胡蘿卜素提取液，迅速測(cè)定吸光值。

1.3.3 類(lèi)胡蘿卜素的定性定其量分析

薄層層析法定性，以硅膠板為固定相，以V(氯仿)∶V(甲醇)＝95∶5為展開(kāi)劑，對(duì)海參卵有機(jī)溶劑提取液和類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行薄層層析，硝酸銀噴霧顯色[8]，對(duì)比樣品Rf值、斑點(diǎn)顏色和斑點(diǎn)大小，初步判定提取液的成分。

分光光度法定量，按照最佳提取條件提取得到的提取液，以空白試劑調(diào)零，在類(lèi)胡蘿卜素最大吸收波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光值。類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照下面公式計(jì)算[9]：

式中：w(類(lèi)胡蘿卜素)為類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg／g；OD450為吸光值；D為稀釋倍數(shù)；V為提取溶劑所需體積，mL；E1%1cm為百分消光系數(shù)，此處取值0.25；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 提取溶劑的選擇

選取丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙醇4種常用溶劑，在其他條件一致的前提下，比較4種溶劑的提取效果，確定最佳提取溶劑。

1.3.5 提取級(jí)數(shù)與溶劑量的選擇

考察倍數(shù)溶劑一次提取與分級(jí)提取的關(guān)系。首先選擇10倍溶劑量一次提取，然后將10倍溶劑量分成5倍、3倍、2倍3個(gè)等級(jí)，浸提3次，結(jié)果同一次提取對(duì)比，比較類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與溶劑用量的關(guān)系。

1.3.6 海參卵中類(lèi)胡蘿卜素最優(yōu)提取條件的確定

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度為因素，其他條件一致的情況下，考察單一因素的不同水平對(duì)提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)海參卵中類(lèi)胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最適工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料含水量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)恒重法測(cè)定原料的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按照實(shí)驗(yàn)方法“1.3.1”中公式計(jì)算樣品中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)3組取均值，結(jié)果表明凍鮮海參卵中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.56%。

2.2 薄層層析結(jié)果

以V(氯仿)∶V(甲醇)＝95∶5為展開(kāi)劑，以類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，進(jìn)行薄層層析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 The thin layer chromatogram

第2個(gè)斑點(diǎn)與類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)Rf值一致，斑點(diǎn)形狀和硝酸銀顯色后顏色基本一致，可以初步確定樣品中該組分為類(lèi)胡蘿卜素。

2.3 提取溶劑的選擇

精確稱(chēng)取4份凍鮮海參卵0.3g放置于離心管中，分別加入3mL的丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙醇，迅速轉(zhuǎn)入預(yù)熱好的40℃的水浴鍋中，避光浸提2h，間歇振蕩。提取后離心，取上清液，在450nm波長(zhǎng)可見(jiàn)光下以提取溶劑為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光值，并計(jì)算出類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，乙酸乙酯的提取效果最好，且其毒性最小，價(jià)格適中，故選用乙酸乙酯為提取溶劑進(jìn)行后面的單因素試驗(yàn)。

2.4 提取級(jí)數(shù)與溶劑量的選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3g原料2份，1份使用10倍溶劑1次提取，另1份選用10倍溶劑量分級(jí)提取，第1次提取溶劑量為5mL，第2次為3mL，第3次為2mL，提取率按照最優(yōu)提取條件下類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 不同提取溶劑對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of different solvent on extraction

表1 提取級(jí)數(shù)與溶劑用量的確定Tab.1 Experimental conditions for the extract times and solvent volume

由表1的提取結(jié)果可知，二次分級(jí)提取的提取率比一次提取的略低，但所用溶劑量比一次提取的少，為提高提取效率節(jié)約溶劑，可采用二級(jí)提取。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 料液比的選擇

精確稱(chēng)取5份凍鮮海參卵0.3g于離心管中，按比例加入1.2、1.8、2.4、3.0、3.6mL乙酸乙酯，40℃水浴避光浸提2h，提取過(guò)程間歇振蕩。提取后離心、取上清液，在450nm波長(zhǎng)可見(jiàn)光下以提取溶劑為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光值，并計(jì)算出類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溶劑倍數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of different multiple solvent on extraction

由圖3可以看出，隨著提取溶劑倍數(shù)的增加，類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)越來(lái)越大，8～12倍溶劑提取效果相差不大，為了節(jié)約溶劑，可以選擇8倍或者10倍溶劑量。

2.5.2 提取時(shí)間的選擇

精確稱(chēng)取7份凍鮮海參卵0.3g于離心管中，各加入3mL乙酸乙酯，40℃水浴避光浸提，浸提時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，提取過(guò)程間歇振蕩。提取后離心，取上清液，在450nm波長(zhǎng)可見(jiàn)光下以提取溶劑為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光值，并計(jì)算出類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of extract time on extraction

由圖4可以看出，在1～3h時(shí)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取效果越好，3h達(dá)到最高點(diǎn)，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而下降，可能是由于類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)不穩(wěn)定容易失活，故應(yīng)選取3h為提取最佳時(shí)間。

2.5.3 提取溫度的選擇

精確稱(chēng)取6份凍鮮海參卵0.3g分別于離心管中，各加入3mL乙酸乙酯，分別在25、30、35、40、45、50℃水浴下避光浸提3h，提取過(guò)程間歇振蕩。離心，取上清液在450nm波長(zhǎng)可見(jiàn)光下以提取溶劑為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光值，并計(jì)算出類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of extract time on extraction

由圖5可以看出，提取溫度為40℃時(shí)提取效果最好，溫度繼續(xù)升高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而下降，可能溫度過(guò)高會(huì)破壞類(lèi)胡蘿卜素結(jié)構(gòu)使其失活，故選擇提取溫度為40℃作為單因素試驗(yàn)的最佳提取溫度。

2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用L9(33)正交試驗(yàn)表，進(jìn)一步對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表2、3。

表2 海參卵中類(lèi)胡蘿卜素提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Tab.2 Orthogonal test of carotenoids extract conditions design and result

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of covariance table

以乙酸乙酯為提取溶劑，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析表明，各因素對(duì)海參卵中類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響順序?yàn)镃(提取溫度)＞A(料液比)＞B(提取時(shí)間)，其中提取溫度為顯著性影響因素(a＝0.05)，方差分析結(jié)果和極差分析結(jié)果相一致，所以確定最佳提取條件組合為A2B2C3，即料液比為1∶12、提取時(shí)間3h、提取溫度40℃，類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)63.20μg／g。

3 結(jié) 論

類(lèi)胡蘿卜素性質(zhì)極其不穩(wěn)定，遇光、熱、空氣都容易分解，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而且導(dǎo)致吸光度下降，提取和測(cè)量時(shí)應(yīng)該盡量在避光低溫下進(jìn)行。

薄層層析結(jié)果表明海參卵中含有一定比例的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)。凍鮮海參卵中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.56%。通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)分析得知，海參卵中類(lèi)胡蘿卜素的最佳提取條件為：以乙酸乙酯為提取溶劑，提取溫度40℃，提取時(shí)間3h，料液比1∶12，類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)63.20μg／g。兩級(jí)提取的類(lèi)胡蘿卜素提取率可達(dá)94.23%，比一級(jí)提取提取率高且節(jié)省提取溶劑。

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