肖 牧，徐 健，何 樂，劉春林，阮 穎*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物種質(zhì)創(chuàng)新和資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長沙410128)

擬南芥NPR1是水楊酸(Salicylic acid)介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途徑中不可或缺的一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助因子，其包含的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域［1］以及錨蛋白重復(fù)序列是行使其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)［2］。在SA誘導(dǎo)下，NPR1被轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi)并與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。它介導(dǎo)植物對(duì)一系列水楊酸途徑應(yīng)答的植物病原菌，如 Pseudomonas syringae和 Peronospora parasitica的抗性。擬南芥中，過量表達(dá)NPR1能夠增加植物對(duì)水楊酸或者功能類似物，如MeSA、BTH的敏感性，但并不會(huì)導(dǎo)致植物的形態(tài)改變，在未受到誘導(dǎo)物或者病原菌刺激的情況下，病原相關(guān)基因PRs(pathogenesis－related gene)的表達(dá)水平亦不會(huì)出現(xiàn)明顯上升。而在受到刺激后則表現(xiàn)出更強(qiáng)的PR1基因誘導(dǎo)以及對(duì)病原菌的抗性［2］。NPR1缺失突變背景下，擬南芥表現(xiàn)出對(duì)各種SAR誘導(dǎo)物不敏感、喪失PR基因表達(dá)以及對(duì)各種細(xì)菌病害易感性增強(qiáng)［3］。有關(guān)NPR1在水楊酸介導(dǎo)的SAR途徑中的作用模式已有詳盡報(bào)道［4］。已知 SAR過程中，NPR1被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)對(duì)于PR基因的轉(zhuǎn)錄激活是必需的，但NPR1蛋白質(zhì)本身并不包含任何DNA結(jié)合序列，且行使生物學(xué)功能的兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(BTB/POZ，ankyrin repeat)均參與蛋白質(zhì)相互作用的過程，這暗示著NPR1在SAR過程中起著一個(gè)間接的調(diào)控作用［2］。進(jìn)一步的研究表明，NPR1出入細(xì)胞核的過程受到SA及類似物觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)調(diào)控［5］。NPR1蛋白之間通常以二硫鍵鏈接而形成多聚體的形態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在受到SA誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)發(fā)生改變而引起二硫鍵被剪切，NPR1多聚體被還原成單體并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。NPR1在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子TGAs或者NIMINs結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合效率，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)下游防御基因進(jìn)行調(diào)控［6，7］。此外，NPR1 亦能夠與擬南芥中與其本身同源的兩個(gè)蛋白——水楊酸受體NPR3，NPR4分別相互作用，且作用模式依賴于接收的SAR信號(hào)的強(qiáng)度，進(jìn)而經(jīng)由泛素化過程，來調(diào)節(jié)NPR1蛋白水平，這個(gè)過程對(duì)于擬南芥中SAR的建立同樣關(guān)鍵［4，8］。

為了進(jìn)一步研究NPR1在植物防御反應(yīng)中的作用，并闡明其在調(diào)節(jié)不同防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的具體作用機(jī)制，本研究利用特異性引物擴(kuò)增哥倫比亞野生型擬南芥中的NPR1基因，并將其分別克隆至pGBKT7、pGADT7酵母雙雜交表達(dá)載體上，為利用酵母雙雜交技術(shù)尋找與NPR1轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用的蛋白并進(jìn)一步理解其在植物防御信號(hào)中的作用模式以及調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(RE)EcoR I、BamH I、T4 ligase、PCR Mix、LongAmp Taq DNA polymerase、PMD19 － T載體購自Takara公司;瓊脂糖(Agarose)購自西班牙Biowest;質(zhì)粒提取試劑盒購自Ambiogen公司;柱式DNA膠回收試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker購自Transgen公司;酵母用培養(yǎng)基購自Sigma;其他常用試劑均為分析純，購自上海國藥。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌DH5α，酵母菌株(Gold菌株)，表達(dá)載體pGBKT7、pGADT7均為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

(1)引物設(shè)計(jì)。根據(jù)NCBI上查找到已公布的NPR1基因編碼區(qū)序列(CDS，全長1 782 bp)，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5，根據(jù)酵母表達(dá)載體pGBKT7、pGADT7的表達(dá)框及多克隆位點(diǎn)，在上下游引物5'端分別接入相應(yīng)的酶切識(shí)別位點(diǎn)EcoR I及BamH I?？寺∷靡锞缮ど锕こ?上海)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下:

NPR1－F:5'GGAATTCCATGGACACCACCAT TGATGGATTCG 3'

NPR1－R:5'CGGGATCCCGTCACCGACGACG ATGAGAGAGTTTA 3'

(2)重組酵母雙雜交質(zhì)粒示意圖如下:

圖1 pGBKT7_NPR1載體構(gòu)建示意圖

圖2 pGADT7_NPR1載體構(gòu)建示意圖

(3)PCR反應(yīng)體系?？傮w積50 μL，無菌去離子水 20 μL，Buffer 6 μL，引物 (10 μM)各1.2 μL，long Taq(2.5 μL)1.2 μL，dNTP(10 mM)0.9 μL，模板cDNA(100 ng)1 μL(擬南芥 cDNA)。

反應(yīng)參數(shù):94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸120 s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)。

(4)T載體連接及大腸桿菌轉(zhuǎn)化。將PCR擴(kuò)增得到目的片段和pMD19－T載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，體系為 10 μL(1 μL vector，4 μL DNA，5 μL solutionⅠ)(具體操作參見Takara公司試劑盒說明書)。

(5)酵母雙雜交載體構(gòu)建。使用限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I對(duì) PMD19－T_NPR1重組質(zhì)粒和pGBKT7、pGADT7載體分別進(jìn)行雙酶切(酶切體系參見Takara公司試劑盒說明書)，瓊脂糖電泳后回收目的基因片段和表達(dá)載體片段(操作參見Transgen公司試劑盒說明書)。在T4連接酶連接體系中將目的基因片段分別與兩個(gè)表達(dá)載體片段連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。挑取陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞

(1)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備。本實(shí)驗(yàn)采用醋酸鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法分別將兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Gold酵母菌株(操作流程以及選用試劑參見Clontech公司MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System User Manual)。

(2)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。將鮭魚精 DNA、酵母感受態(tài)細(xì)胞以及重組質(zhì)?；靹蚝蠹?.7 mL PEG/LiAc溶液，30℃振蕩培養(yǎng)30 min，再加入0.07 mL DMSO混勻，于42℃熱激15 min，冰浴15 min，離心后棄上清，將沉淀重懸于1.5 mL 1×TE緩沖液中，分別涂布至缺少相應(yīng)氨基酸的SD篩選平板。28℃恒溫箱里倒置培養(yǎng)，直至長出酵母陽性克隆。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增擬南芥NPR1基因

圖3 LongAmp酶擴(kuò)增得到的NPR1全長CDS

以引物的Tm降低5℃為基準(zhǔn)，上下加減5℃設(shè)計(jì)退火溫度梯度 PCR，確定最佳的退火溫度為55℃。以55℃為退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離出目的片段，大小與預(yù)期一致(1 800 bp左右)(圖3)。

2.2 NPR1全長CDS與T－Vector連接及測(cè)序結(jié)果分析

切膠回收擴(kuò)增出的1 782 bp左右的目的片段，在T4連接酶作用下將其連接到pMD19－T，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取100 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含有氨芐青霉素50 g/mL)生長，篩選獲得陽性克隆。隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子。

挑取菌落PCR檢測(cè)為陽性的單菌落，接種至含有50 mg/mL Amp的5～10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm振蕩培養(yǎng)。過夜后提取質(zhì)粒，利用EcoR I、BamH I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。挑選驗(yàn)證正確后的克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示去除酶切位點(diǎn)后序列長度為1 782 bp。經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)，與已公布的擬南芥NPR1全長CDS序列一致。

2.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果與已公布序列比對(duì)完全一致的NPR1片段與載體pGBKT7、pGADT7分別經(jīng)EcoR I、BamH I雙酶切后，用T4連接酶連接，構(gòu)建酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到陽性克隆后，進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證(圖4)。雙酶切后電泳檢測(cè)到約1 800 bp的目的片段，說明載體構(gòu)建成功。用BamHⅠ進(jìn)行單酶切時(shí)出現(xiàn)兩條帶可能是由于單酶切體系中的BamHⅠ錯(cuò)誤識(shí)別堿基序列并進(jìn)行切割或者由于質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制時(shí)出現(xiàn)堿基突變所致。

圖4 pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1質(zhì)粒酶切結(jié)果

2.4 重組質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1分別轉(zhuǎn)化至Gold酵母菌株中，熱激轉(zhuǎn)化后將菌懸液涂布于SD/－Trp與SD/－Leu培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后，觀察酵母菌的生長情況(圖5)。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入到宿主酵母菌細(xì)胞內(nèi)。

圖5 含NPR1 CDS重組質(zhì)粒的Gold酵母菌轉(zhuǎn)化子

3 討論與小結(jié)

在各種植物防御途徑中，SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)已見大量報(bào)道，并且被認(rèn)為是植物應(yīng)對(duì)細(xì)菌性病害過程中十分關(guān)鍵的機(jī)制［9］。SAR過程發(fā)生在受感染植株的健康部位中。植物局部組織受到病原菌侵染后，一類可移動(dòng)的信號(hào)分子通過維管系統(tǒng)運(yùn)輸至其它部位并且啟動(dòng)相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)［10］，如激素水平提高、防御基因表達(dá)、次級(jí)代謝物累積、形態(tài)學(xué)改變等。水楊酸作為SAR信號(hào)途徑起始位點(diǎn)中必不可少的一種信號(hào)分子，它介導(dǎo)著一大類編碼具有抗菌作用的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)［11］。在水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，NPR1被證明是必需的一個(gè)反式作用因子［3］。水楊酸信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)的改變，NPR1被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，并與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用［12］，進(jìn)而調(diào)控防御基因的轉(zhuǎn)錄［1，2，6，7，13］。然而，SA途徑與其它信號(hào)途徑的相互調(diào)節(jié)作用機(jī)理尚不清楚。因此，研究NPR1與其它可能參與調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用模式十分必要。

本研究利用基因重組將擬南芥NPR1全長CDS分別克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7與pGADT7中。重組質(zhì)粒通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化獲得了陽性克隆，經(jīng)過菌落PCR及單、雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒又轉(zhuǎn)化到Gold酵母菌中，并且在相應(yīng)篩選培養(yǎng)基上成功獲得了轉(zhuǎn)酵母菌成功的陽性克隆。本研究結(jié)果為利用NPR1進(jìn)行酵母篩庫以及蛋白相互作用的驗(yàn)證奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步研究NPR1與其它可能參與調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用模式，進(jìn)一步闡明NPR1在信號(hào)傳導(dǎo)途徑互作中行使的功能。

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