支添添，周 舟，韓成云，任春梅，2*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128;2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙410128)

細(xì)胞死亡在植物生長發(fā)育和抵抗逆境方面具有重要意義:在細(xì)胞水平上，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞數(shù)量平衡的重要手段;在發(fā)育中，細(xì)胞死亡有形態(tài)建成和去除無用組織細(xì)胞的作用，而且還是抵御病原物入侵和環(huán)境脅迫的重要機(jī)制之一［1］。植物在遇到環(huán)境脅迫如病害、高鹽、水澇和低溫時，某些部位需要發(fā)生細(xì)胞死亡來度過不良環(huán)境，這是植物在進(jìn)化過程中自身形成的對環(huán)境的適應(yīng)能力。臺盼藍(lán)(Trypan blue)或稱臺盼蘭、錐蟲藍(lán)、曲利苯藍(lán)，是一種高分子量的活性染色劑，分子量:960.8 OD［2］。它是細(xì)胞活性染料，常用于檢測細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡檢測被廣泛應(yīng)用于多個科研領(lǐng)域，如藥物篩選［3］、細(xì)胞增殖測定［4］、藥物毒性測定［5］、腫瘤藥敏實驗［6］等。目前最常用的檢測細(xì)胞死亡的方法是臺盼藍(lán)染色法。

本實驗以模式植物擬南芥為材料，采用臺盼藍(lán)染色的方法對細(xì)胞死亡進(jìn)行檢測，旨在確證突變體sdl1細(xì)胞死亡的發(fā)生，為進(jìn)一步研究突變體sdl1奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Columbia(Col－0)及突變體sdl1，由本實驗室提供;臺盼藍(lán)，L－乳酸:Amresco公司;苯酚:北京索萊寶科技有限公司;甘油:天津市恒興化學(xué)試劑有限公司(A.R.);水合氯醛:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(A.R.);瓊脂粉和蔗糖購自市場。

智能人工氣候箱:PRX－450B;體視顯微鏡:Nikon C －DS。

1.2 培養(yǎng)方法

用消毒液(20%bleach+0.1%Triton100)將Col－0野生型及sdl1突變體種子浸泡8～10 min后，用無菌水清洗3～4次，鋪種在含1%蔗糖的MS培養(yǎng)基上，4℃下春化3 d后轉(zhuǎn)入設(shè)定光周期為16 h黑暗/8 h光照的人工氣候箱生長5～8 d，培養(yǎng)溫度22±2℃，光照強(qiáng)度80 ～120 μmol/m2·s，相對濕度65%。

1.3 染色方法

野生型擬南芥葉片和突變體擬南芥葉片浸泡在臺盼藍(lán)染液中，沸水浴染色2 min，自然冷卻后室溫染色過夜，后于1.25 g/mL(250 g水合氯醛用40 mL蒸餾水溶解，定容至200 mL)或1.12 g/mL(224 g水合氯醛用40 mL蒸餾水溶解，定容至200 mL)水合氯醛脫色3 d，每天換一次脫色液。體視顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況并拍照記錄。

臺盼藍(lán)染液配方:2.5 g臺盼藍(lán)溶于1 mL乳酚﹝25%乳酸(質(zhì)量體積比)，23%水溶苯酚，25%甘油，其余是無菌水﹞。

2 結(jié)果與分析

2.1 sdl1突變體的表型

突變體sdl1從第6天開始，小苗葉片出現(xiàn)先萎蔫、后白化現(xiàn)象，第7天可看到突變體sdl1小苗葉片出現(xiàn)全綠、半萎蔫半綠、半綠半白、全白4種情況，并且停止生長，到第8天幾乎所有突變體sdl1小苗的葉片全部白化。

2.2 不同天數(shù)突變體sdl1葉片白化率統(tǒng)計比較

分別將第6天、第7天、第8天葉片出現(xiàn)部分萎蔫、部分白化和完全白化的突變體sdl1株數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。統(tǒng)計結(jié)果顯示隨著天數(shù)的增加，突變體sdl1小苗完全白化率隨之增加，而全綠和部分白化的比率隨之減少，說明隨著天數(shù)的增加，突變體sdl1葉片白化的速度加快(表1)。

表1 不同天數(shù)突變體sdl1小苗葉片白化率比較

2.3 野生型Col－0及突變體sdl1的臺盼藍(lán)染色

對生長7 d的野生型Col－0和突變體sdl1小苗進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，并在體視顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)只有突變體半萎蔫半綠小苗子葉萎蔫處出現(xiàn)藍(lán)色沉淀，完全白化小苗和野生型小苗沒有(圖1)。

圖1 生長7 d的擬南芥野生型小苗子葉(A)、突變體sdl1白化小苗子葉(B)以及萎蔫小苗子葉(C)的臺盼藍(lán)染色結(jié)果

3 結(jié)論

擬南芥野生型Col－0和突變體sdl1直接鋪種于MS+1%sucrose培養(yǎng)基上，在光照周期為16 h黑暗/8 h光照條件下生長到第6天，突變體sdl1葉片開始出現(xiàn)部分萎蔫和白化，隨著天數(shù)的增加植株葉片白化率不斷升高，生長8～9 d后幾乎所有突變體葉片全部變白，而野生型正常。經(jīng)臺盼藍(lán)染色證實突變體sdl1發(fā)生細(xì)胞死亡，但完全死亡(完全白化)后不能被染色，所以臺盼藍(lán)染色只能對突變體sdl1細(xì)胞死亡的早期進(jìn)行鑒定。野生型不能被染色是因為沒有發(fā)生細(xì)胞死亡，白化部分猜測是由于細(xì)胞完全死亡，DNA降解，不能與臺盼藍(lán)結(jié)合形成藍(lán)色沉淀，因而不能被染色。

［1］ Reape TJ，McCabe PF.Apoptotic － like programmed cell death in plants［J］.New Phytologist 2008，180:13 －26.

［2］ 齊世欣，李筱榮.臺盼藍(lán)染色在玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)，2005，29(4):263－266.

［3］ Li Q，Maddox C，Rasmussen L，et al.Assay development and high－through put antiviral drug screening against Bluetongue virus［J］.Antiviral Res，2009，83(3):267－273.

［4］ Ye YW，Wu JH，Wang CM，et al.Sox17 regulates proliferation and cell cycle during gastric cancer progression［J］.Cancer Lett，2011，307(2):124 －131.

［5］ Yan F，Zhang C，Zheng Y，et al.The effect of poloxamer 188 on nanoparticle morphology，size，cancer cell uptake，and cytotoxicity［J］.Nanomedicine，2010，6(1):170－178.

［6］ Wang CX，Huang LS，Hou LB，et al.Antitum or effects of polysorbate－80 coated gemcitabine polybutylcyanoacrylate nanoparticles in vitro and its pharmacodynamics in vivo on C6 glioma cells of a brain tumor model［J］.Brain Res，2009，1261:91－99.