楊輝德

(黃岡職業(yè)技術學院生物化工學院，湖北 黃岡 438002)

天麻是名貴中藥材，現已由傳統(tǒng)醫(yī)用發(fā)展到飲食及滋補保健等行業(yè)，社會需求量急增，導致天麻種植的共生菌蜜環(huán)菌菌種生產量也與日俱增。但隨著對蜜環(huán)菌生長習性認識的逐步深入，筆者發(fā)現蜜環(huán)菌母種生產中存在的一些問題。一是蜜環(huán)菌母種在斜面培養(yǎng)生長不理想;二是蜜環(huán)菌在瓊脂培養(yǎng)基上極易產生褐化及角質化，使菌種發(fā)生退化;三是傳統(tǒng)從試管表面轉管與擴繁容易導致污染。上述問題均影響了制作蜜環(huán)菌母種的質量與轉擴成功率。通過對上述問題的試驗探索，在借鑒他人經驗的基礎上，進行大膽的探索與改革，很好地解決了上述問題，現總結如下。

1 蜜環(huán)菌母種的生產與轉擴中存在的問題

在多年培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種實踐中，開始對蜜環(huán)菌不太了解，在培養(yǎng)基配制、試管分裝、母種轉管與擴繁中總按對待其它食用菌的辦法進行操作，并沒有考慮蜜環(huán)菌生長的個性要求。在實際生產中出現一些不盡人意的事情，如斜面培養(yǎng)菌種量過小、PDA培養(yǎng)基種性易退化、從試管表面接種易污染等問題。

1.1 試管斜面培養(yǎng)菌種量小

傳統(tǒng)上蜜環(huán)菌母種采用試管斜面培養(yǎng)，主要考慮增加菌種與氧氣的接觸面積，通常是18 mm×180 mm試管裝7 mL～8 mL，或20 mm×200 mm試管裝10 mL～12 mL，所裝高度只占試管1/5～1/4 之間。擺成斜面后高度占試管 1/2 ～3/5 之間，所裝液量較少，培養(yǎng)母種量有限。

1.2 PDA培養(yǎng)基種性易退化

蜜環(huán)菌母種制作，不管是菌種制作廠家還是天麻種植者，大多采用傳統(tǒng)的PDA、PDA加富或PDA+黃豆粉等培養(yǎng)基。這些傳統(tǒng)培養(yǎng)基有許多不足之處一是不能為蜜環(huán)菌提供充分的營養(yǎng)來源;二是由于蜜環(huán)菌是喜濕性菌類，在培養(yǎng)基上更易吸收游離態(tài)水，而傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)基以結合態(tài)水為主要存在形式，不能很好地為其提供所需水分，致使蜜環(huán)菌的生長受到一定抑制;三是在瓊脂培養(yǎng)基上，菌種容易產生褐化及角質化，這是蜜環(huán)菌退化的標志，因而影響了培養(yǎng)母種的質量，降低了天麻生產產量。

1.3 固體培養(yǎng)生長不理想

傳統(tǒng)的蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)均采用瓊脂作凝固劑，這都源于對蜜環(huán)菌缺乏了解。蜜環(huán)菌是喜濕性菌類，更易于吸收游離態(tài)水，在瓊脂作凝固劑中以白色菌索形式出現，但分枝較少;而在原料為主的半固體培養(yǎng)基中也以白色菌索形式出現，但分枝較多，生長更旺。

1.4 從試管表面接種易污染

在后期生長中，蜜環(huán)菌母種在菌柱表面分泌色素形成老菌皮，上面還形成菌索伸向試管口。因而從試管表面接種增加了接種操作難度，同時隨著保藏時間的延長，母種菌柱上部會失水干縮并產生色素，這一部分菌種更容易出現退化問題;再者菌種在長期保藏中菌種表面可能有雜菌，致使從試管表面接種易污染，母種轉管與擴繁成功率不高。

2 蜜環(huán)菌母種生產與轉擴的改革方法

2.1改試管斜面為試管菌柱

由于蜜環(huán)菌母種能以菌索方式存在，菌索有輸送氧氣的能力。因此，蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)可改用試管菌柱方式進行。試管菌柱制作減少了擺斜面的操作環(huán)節(jié)，菌柱高度與試管斜面同樣只占試管1/2～3/5之間，用18 mm×180 mm試管裝液量為18 mL～20 mL，20 mm×200 mm試管裝液量23 mL～25 mL，裝液量是試管斜面的2.5倍。試管菌柱培養(yǎng)的母種見圖1，從而在同樣的容器中提高了母種的生產數量，節(jié)約成本，提高效益。

2.2 改固體方式為半固體方式

使用玉米粉100 g、黃豆粉10 g、麥麩80 g、蔗糖 (白糖)20 g、水1 000 mL作培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種的的配方。培養(yǎng)基的狀態(tài)呈半固體狀，具有流動性。先將稱量好的玉米粉、黃豆粉、麥麩用適量水調勻。再添足水煮制，待煮沸時開始記時，保持35 min即可，注意在加熱過程中需不時攪拌，以免煮糊。注意適量添水，以補充加熱過程中損失的水分。煮好后加入所需的蔗糖，趁熱采用注射筒或其他裝置分裝。分裝后塞好棉塞，將試管豎直放置。由于該培養(yǎng)基營養(yǎng)相當豐富，再加上玉米粉徹底滅菌相對較難。因此滅菌時間應比常規(guī)培養(yǎng)基稍長一點，一般將其控制在高壓條件下0.15 MPa下滅菌35 min～40 min。滅菌完成后，待冷卻至試管不燙手時將其取出，豎直放置，待完全冷卻后再開始接種操作。采用玉米粉等原料半固體方式培養(yǎng)的蜜環(huán)菌母種見圖2。

2.3 改PDA培養(yǎng)基為綜合培養(yǎng)基

用傳統(tǒng)的PDA、PDA加富、PDA+黃豆粉等培養(yǎng)基培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種，菌種呈菌索狀，菌索生長粗狀，分枝也多，在菌柱表面分泌的色素多，易形成褐化及角質化。而用馬鈴薯100 g、木屑 50 g、麥麩 50 g、玉米粉 50 g、瓊脂 10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB110 mg、水1 000 mL的綜合配方培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種，培養(yǎng)的母菌呈菌絲狀，菌絲分枝細密，生長勢強，日平均生長速度達5.18 mm·d－1。且經1年時間保藏失水不嚴重、耐貯藏，與PDA培養(yǎng)基配母種質量有顯著差異，在推廣中增產明顯。

2.4 改試管表面轉擴為試管底部破碎轉擴

鑒于蜜環(huán)菌母種從試管表面接種易污染的現實，筆者進行了多次改從試管底部破碎轉擴試驗，成功率高達98%。具體操作步驟如下:第一步挑選健壯的母種試管;第二步在試管下半部菌柱的部位用寬透明膠帶纏繞并用75%酒精消毒;第三步在超凈工作臺或接種箱中敲碎管底，無菌操作中一只手拿試管口棉塞處，另一只手用鑷子從試管底部破碎處挑取母菌進行轉擴接種。操作步驟與操作方法見圖3。

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