詹合琴 李生瑩 李平法 閆福林 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

神經(jīng)生長因子(NGF)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復(fù)有著重要的作用，具有維持神經(jīng)元存活、參與受損神經(jīng)元修復(fù)等作用〔1〕。腦缺血后NGF的表達增多可能是產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的內(nèi)源性機制〔2～4〕，但是這種表達的上調(diào)維持時間短，程度不強。高翅果菊提取物Lactuside B(LB)是從河南高翅果菊屬植物中提取得到的一種單體化合物，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腦缺血作用〔5〕，但作用機制所知甚少。本實驗探討LB對大鼠腦缺血后海馬和紋狀體NGF mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、主要試劑及儀器 尼莫地平注射液(購于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三附院);溴乙啶、純DEPC液、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、D2000 DNA分子量標記物和Trizol等產(chǎn)品(均購于鄭州博興生物科技有限公司);loading buffer和RT-PCR試劑盒(購于鄭州久是生物技術(shù)有限責任公司);水合氯醛粉劑、無水乙醇、異丙醇和氯仿(購于新鄉(xiāng)市世紀元化玻器械有限公司)。DYY-7C型水平電泳儀(北京市六一儀器廠產(chǎn));Eppendorf AG PCR擴增儀(德國Eppendorf公司產(chǎn));UV-2102PC紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司產(chǎn));TGL-16G-A臺式高速低溫離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn));SANYO MDF-U4086S超低溫冰箱(日本SANYO公司產(chǎn));TOCAN240凝膠成像系統(tǒng)(上海領(lǐng)成生物科技有限公司產(chǎn))。

1.2 實驗樣品LB的分離鑒定 采集高翅果菊植物，取其根部陰干后粉碎，按照本實驗小組的提取步驟和方法〔5〕，獲取足夠?qū)嶒炇褂玫腖B(為白色粉末狀，純度＞98%)。

1.3 實驗動物、分組與給藥 清潔健康Ⅱ級雄性SD大鼠，體重(300±20)g，購自河南省實驗動物中心，動物合格證號:SYXK(豫)2005-0012。實驗過程對動物的處理符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標準〔6〕。動物隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(尼莫地平1 mg/kg)、LB低劑量組(12.5 mg/kg)、LB中劑量組(25 mg/kg)、LB 高劑量組(50 mg/kg)，共6 組，8 只/組，各組于再灌注后24、72 h分別處死各組動物的一半。所有動物于再灌后每天給藥2次，均按5 ml/kg腹腔注射給藥。假手術(shù)組、模型組分別給予等體積的生理鹽水，陽性對照組給予尼莫地平，LB低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的實驗藥物。

1.4 大鼠大腦中動脈阻塞線的制備 1.5號日本漁線(Da-Dong Yang生產(chǎn)制造)，直徑0.2 mm，剪成4 cm長的數(shù)小段，將其末端靠近火焰燒圓，在長2.0 cm處做標記，放入多聚L賴氨酸和肝素混合(2∶1)溶液中浸泡備用。

1.5 大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型的制備及神經(jīng)缺失癥狀評分 參照Longa線栓法和神經(jīng)缺失癥狀評分法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注損傷模型(阻塞線插入深度為2.0 cm，假手術(shù)組阻塞線插入ICA長度為0.5 cm左右)，并對各組動物進行神經(jīng)功能評分，14分者為成功模型動物。

1.6 RT-PCR方法檢測NGF基因的轉(zhuǎn)錄水平 大鼠斷頭取腦，稱取80 mg腦梗死區(qū)周圍大腦皮質(zhì)在液氮中磨碎，Trizol一步法提取總RNA，檢測其純度和濃度保證所提的RNA無降解和污染。用TaKaRa primeScript TM RT-PCR試劑盒擴增NGF基因片段，NGF上游引物為5'-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3'，下游引物為5'-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3'，擴增產(chǎn)物長度為344 bp。PCR反應(yīng)液為50 μl，反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán);72℃ 10 min，以 β-actin為內(nèi)參，上游引物為5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3'，下游引物為5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'，擴增產(chǎn)物長度為208 bp。PCR產(chǎn)物各取2.5 μl，1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄。用Quantity One圖像分析軟件測定各條帶灰度，以擴增的特異性目的片段灰度值與同時擴增的內(nèi)參β-actin片段灰度值的比值作為特異性擴增目的片段的半定量檢測值，每組每只實驗重復(fù)3次，求其平均值。

2 結(jié)果

2.1 LB對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬各時段NGF mRNA表達的影響 腦缺血后海馬模型組NGF基因表達明顯增多，但再灌注72 h NGF基因表達顯著下降，用藥后，LB各劑量組NGF mRNA表達增多，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對照藥比較中、低劑量組有顯著性差異(P＜0.01);LB中、低劑量組用藥72 h后 NGF mRNA表達更多，與用藥24 h比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2 Lactuside B對大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦紋狀體組織各時段NGF mRNA表達的影響 結(jié)果顯示:腦缺血后紋狀體模型組NGF基因表達增多，再灌注72 h時NGF基因表達顯著下降。用藥后，Lactuside B各劑量組NGF mRNA表達增加，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對照藥比較其高、低、中、高劑量組均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05);LB用藥72 h時中、低劑量組NGF mRNA表達更多，與用藥24 h比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表2、圖1。

表1 各組大鼠海馬不同時段NGF mRNA的表達(n=8，±s)

表1 各組大鼠海馬不同時段NGF mRNA的表達(n=8，±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與陽性對照藥比較:2)P＜0.01;與缺血再灌24 h比較:3)P＜0.05

組別 缺血再灌24 h 缺血再灌72 h假手術(shù)組0.21±0.01 0.19±0.01模型組 0.27±0.01 0.23±0.00陽性對照藥組 0.36±0.021) 0.38±0.011)LB低劑量組 0.44±0.011)2) 0.48±0.021)2)3)LB中劑量組 0.68±0.021)2) 0.73±0.011)2)3)LB高劑量組 0.35±0.021) 0.40±0.021)

表2 各組大鼠紋狀體不同時段NGF mRNA的表達(n=8，±s)

表2 各組大鼠紋狀體不同時段NGF mRNA的表達(n=8，±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與陽性對照藥比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與24 h比較:4)P＜0.05

組別IR 24 h IR 72 h假手術(shù)組0.24±0.01 0.19±0.01模型組 0.30±0.01 0.22±0.01陽性對照組 0.33±0.011) 0.42±0.021)LB低劑量組 0.52±0.011)2) 0.75±0.021)2)4)LB中劑量組 0.66±0.011)2) 1.01±0.021)2)4)LB高劑量組 0.35±0.001)3) 0.46±0.021)3)

圖1 各組大鼠海馬、紋狀體不同時段NGF mRNA的表達

3 討論

腦部的血液供應(yīng)主要靠頸內(nèi)動脈系統(tǒng)和椎-基底動脈系統(tǒng)。其中脈絡(luò)前動脈主要供應(yīng)紋狀體、海馬、外側(cè)膝狀體等組織區(qū)域，而后交通動脈、大腦前動脈和大腦中動脈主要供應(yīng)眼部和大腦半球前3/5部分的血液〔7〕。一旦發(fā)生腦缺血性事件，腦部供血則嚴重受阻，除了大腦皮質(zhì)的缺血性損傷外，海馬和紋狀體組織對缺血和再灌注損傷也非常敏感〔8，9〕。

腦缺血是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是全世界因腦血管疾病致殘的重要病因。缺血性腦中風的類型在臨床上以大腦中動脈阻塞(MCAO)為主，腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體的神經(jīng)元會發(fā)生損傷，隨著病情的加重更會造成神經(jīng)元的死亡。目前，減少神經(jīng)元死亡，促進損傷腦組織的修復(fù)等神經(jīng)保護措施在臨床上仍然占有十分重要的地位。

有許多研究證明，腦缺血再灌注損傷后具有自我修復(fù)的潛力，且其修復(fù)與非神經(jīng)元區(qū)的神經(jīng)再生以及神經(jīng)生長因子的表達有著密切的關(guān)系〔10，11〕。腦缺血缺氧后，NGF的應(yīng)激性表達上調(diào)可改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)〔12〕。

本實驗選擇大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型，研究了LB對腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬和紋狀體NGF mRNA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LB在不同時段均可上調(diào)二部位NGF mRNA的表達，中低劑量組的作用效果優(yōu)于陽性對照藥尼莫地平，且用藥72 h NGF mRNA表達更多。這些結(jié)果提示了LB對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其能夠維持海馬和紋狀體高水平的內(nèi)源性神經(jīng)生長因子有關(guān)。

眾所周知，NGF的分子量很大難以透入血腦屏障，故用其治療腦缺血損傷在臨床上難以湊效。LB能夠增加內(nèi)源性神經(jīng)生長因子表達的機制在分子水平上揭示了其抗腦缺血再灌注損傷的一角，為LB作為抗腦缺血損傷新藥的進一步研究提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 Luk YO，Chen WY，Wong WJ，et al.Treatment of focal cerebral ischemia with liposomal nerve growth factor〔J〕.Drug Deliv，2004;11(5):319-24.

2 Semkova I，Krieglstein J.Neuroprotection mediated via neurotrophic factors and induction of neurotrophic factors〔J〕.Brain Res Rex，1999;30(2):176-81.

3 Semkova I，Wolz P，Schilling M，et al.Selegilene enhances NGF synthesis and protects central nervous system neurons from excitotoxic and ischemic damage〔J〕.Eur J Pharmacol，1996;315(1):19-30.

4 李 檀，陳 霞，王淑麗，等.中藥聯(lián)合干細胞蛛網(wǎng)膜下腔移植對缺血再灌注大鼠腦脊液NGF的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011;29(3):532-4.

5 詹合琴，郭蘭青，崔建敏，等.高翅果菊化學(xué)成分及l(fā)actuside B的抗腦缺血活性研究〔J〕.中草藥，2010;41(5):692-6.

6 楊漢林.淺談落實《善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的幾點看法〔J〕.當代醫(yī)學(xué)，2008;148(1):46-7.

7 劉珂舟.腦缺血及再灌注過程中大鼠海馬區(qū)一氧化氮動態(tài)變化的在體研究〔D〕.杭州:浙江大學(xué)，2009.

8 宋月英，閆玉仙，陳海生，等.三七總皂苷對缺血再灌注大鼠腦組織CaMⅡβmRNA及蛋白的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(5):835-7.

9 Hou SW，Wang YQ.Functional integration of newly generated neurons into striatum after cerebral ischemia in the adult rat brain〔J〕.Stroke，2008;39:2837-44.

10 Parent JM，Vexler ZS，Gong C，et al.Rat forebrain neurogenesis and striatal neuron replacement after focal stroke〔J〕.Ann Neurol，2002;52:802-13.

11 Wang YQ，Guo X，Qiu MH，et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.J Neurosci Res，2007;85:73-82.

12 Tang XQ，Cai J，Nelson KD，et al.Functional repair after dorsal rootrhizotomy using nerve conduits and neurotrophic molecules〔J〕.Eur J Neurosci，2004;20(5):1211-8.