王彥春 王培峻 馬 駿 許永海 梁少榮 何 方 周 丹 (湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061)

帕金林病(PD)的病因和發(fā)病機制迄今仍未徹底明確。針對線粒體功能改變的研究，對闡明PD的發(fā)病機制及指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。臨床針對PD的治療主要用多巴類藥物以補充腦內(nèi)DA的含量，改善患者癥狀，但不能抑制疾病的發(fā)展且具有明顯的副作用。而針灸療法能提高L-D A類藥物療效，降低藥物劑量和減少并發(fā)癥，有效減緩PD發(fā)展，是一種安全的自然療法〔1，2〕，但機制不明。本實驗通過觀察電針對 PD模型大鼠的黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元數(shù)目及線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ活性的影響，初步探討電針治療PD。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 魚藤酮(Rotenone)及葵花油乳化液(Sunflower oil)購于Sigma公司，水合氯醛、多聚甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒，線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ活性比色法定量檢測試劑盒購于GENMED公司。G6805電針治療儀，低溫超速離心機，752紫外可見分光光度計等。

1.2 實驗動物 清潔級 SD大鼠48只，雄性，體重180～220 g，購于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗中心，許可證號:SCXK(鄂)2004-0007。經(jīng)過三次行為測試確認(rèn)無自發(fā)行為異常后隨機分為4組:①正常組;②溶劑對照組;③模型組;④電針治療組。正常組不做任何處理，假手術(shù)組只注射不含魚藤酮的等量葵花油乳化液，余下2組先造模，再作相應(yīng)處理。

1.3 PD大鼠模型制備 將魚藤酮溶解于葵花油乳化液中，濃度為2 mg/ml，棕色試劑瓶保存。取大鼠稱重，采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備模型，注射劑量為2 mg·kg-1·d-1。每天注射一次，連續(xù)注射28 d，制備PD大鼠模型。通過觀察大鼠的行為學(xué)改變及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測中腦黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目以確定PD模型造模成功。

1.4 電針治療 電針治療組大鼠自造模7 d后開始電針治療，參照華興邦《實驗動物穴位圖譜》〔3〕取風(fēng)府、太沖(太沖穴隔天左右交替使用)，用0.5寸毫針針刺，接G6805電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，每次治療30 min，每天1次，治療21 d。

1.5 行為學(xué)觀察 自造模開始后，每天注意觀察和記錄各組大鼠的毛色、弓背、拒捕行為、不自主運動等行為。采用陳忻等〔4〕制定的魚藤酮PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分體系對大鼠的行為學(xué)改變進行評分，記錄造模7 d(開始電針治療)及造模28 d(電針治療結(jié)束)大鼠的行為學(xué)評分。

1.6 免疫組化染色檢測TH的表達 每組隨機選取6只大鼠以水合氯醛麻醉后，先用250 ml生理鹽水行左心室灌流，再用0.1 mmol/L的PBS配制的4%的多聚甲醛溶液灌注固定。取出腦組織置于4%的多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h，石蠟包埋后行連續(xù)冠狀切。免疫組化SABC法檢測TH。免疫組織化學(xué)圖像采用Image-Pro Plus software對切片進行圖像分析，所有切片均采用同一光強度，每個標(biāo)本取相鄰的3張切片，觀察黑質(zhì)區(qū)相同面積，分析陽性數(shù)密度及陽性面密度。

1.7 線粒體的提取 余下各組大鼠用水合氯醛麻醉后，于冰盤上迅速斷頭取出中腦黑質(zhì)組織塊，置于液氮罐中保存。使用GENMED動物組織線粒體分離試劑盒，采用組織勻漿法提取線粒體，放進-70℃冰箱中保存。

1.8 線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ活性檢測 運用線粒體復(fù)合物活性比色測定相應(yīng)線粒體復(fù)合物的活性，具體的操作步驟參照定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書用紫外分光光度法進行測定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異采用t檢驗分析。結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 電針對PD模型大鼠行為學(xué)的影響 自造模開始3～5 d后，模型組逐漸出現(xiàn)毛色變臟變黃、運動緩慢、弓背、拒捕行為減弱及震顫等不自主運動，且隨著造模時間延長，上述表現(xiàn)逐步加重。電針治療組自造模開始3～5 d后出現(xiàn)上述癥狀，但造模結(jié)束時電針治療組大鼠行為學(xué)改變明顯較模型組減輕，差異顯著(P＜0.05)。正常組和溶劑對照組均未見上述行為學(xué)改變。見表1。

2.2 電針對PD模型大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目的影響 TH免疫組織化學(xué)染色顯示，正常組和溶劑對照組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)有條帶狀TH免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物，分布較集中(63.17±7.47，64.67±5.96);與正常組及溶劑對照組相比，模型組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH表達顯著降低(25.33±3.88，P＜0.01);電針治療組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH表達較模型組顯著增強(33.50±3.02，P ＜0.01)，見圖1。

2.3 電針對PD模型大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ活性的影響 模型組線粒體復(fù)合物Ⅰ較正常組顯著降低，電針治療組線粒體復(fù)合物Ⅰ較模型組顯著升高，正常組與溶劑對照組之間無顯著差異。線粒體復(fù)合物Ⅱ～Ⅳ的活性在各組間無顯著差異。見表2。

表1 模型組與電針治療組大鼠行為學(xué)評分(±s，n=12)

表1 模型組與電針治療組大鼠行為學(xué)評分(±s，n=12)

組別 造模7 d 造模28 d模型組1.5±0.53 6.8±1.35電針治療組1.6±0.52 5.0±0.94

圖1 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的表達(TH，×200)

表2 各組大鼠腦黑質(zhì)細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ的變化(±s，n=12)

表2 各組大鼠腦黑質(zhì)細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ的變化(±s，n=12)

組別 ComplexⅠ ComplexⅡ ComplexⅢ ComplexⅣ正常組 111.42±13.25 44.88±6.39 39.33±4.98 90.23±11.11溶劑對照組 109.63±8.64 45.95±8.39 37.57±2.76 87.32±9.25模型組 51.61±3.67 42.97±8.53 34.03±4.15 91.47±10.16電針治療組 77.65±6.32 43.55±11.35 34.50±3.16 93.35±8.17

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所。線粒體呼吸鏈主要由5個酶復(fù)合物 (復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ)構(gòu)成，是電子傳遞和最終合成 ATP的場所。復(fù)合物Ⅰ(NADH-CoQ還原酶)是線粒體呼吸鏈中最大的一個復(fù)合體，由NADH脫氫酶和一系列鐵硫蛋白組成。它是由mtDNA轉(zhuǎn)錄的mRNA編碼的亞單位組成，由于mtDNA易受自由基攻擊以及缺少組蛋白的保護而易發(fā)生突變〔5〕。Parkin、PINK1、DJ-1等是常染色體隱性遺傳性家族性PD常見的基因突變位點〔6，7〕。這些家族性PD相關(guān)基因編碼蛋白對維持線粒體的形態(tài)和功能具有重要的作用，例如在Parkin敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈活性降低〔8〕。相關(guān)實驗也報道了PD模型動物的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性明顯下降〔9～11〕。顯然，線粒體的功能障礙在PD的發(fā)病中占有重要的作用和地位。通過對整體魚藤酮PD模型大鼠的研究觀察到:動物出現(xiàn)行為學(xué)異常，線粒體復(fù)合物Ⅰ活性明顯降低，而線粒體復(fù)合物Ⅱ～Ⅳ的活性無顯著變化。通過對線粒體呼吸鏈整體水平的研究，證明魚藤酮造成的黑質(zhì)紋狀體損傷與它抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性有直接的關(guān)系，由此推斷魚藤酮抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性是它選擇性損害DA能神經(jīng)元的始動性因素。同時更進一步證明了線粒體功能障礙在PD發(fā)病中的重要地位，尤其是線粒體復(fù)合物Ⅰ的功能。針灸是治療PD重要的手段之一。臨床多有報道針灸治療該病不僅改善病人的癥狀，使美多巴減量而療效不受影響，且西藥引起的運動波動及異動癥等副作用明顯減輕〔12，13〕。本實驗中，在大鼠出現(xiàn)行為學(xué)改變時，即對大鼠進行電針治療，體現(xiàn)了中醫(yī)的“未病先防，既病防變”思想。研究中觀察到，電針治療組線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性較模型組明顯增強，電針治療組大鼠的行為學(xué)改變較模型組顯著減輕，提示增強線粒體復(fù)合物Ⅰ活性、改善線粒體電子傳遞鏈功能可能是針刺治療帕金森病的機制之一。

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