郝欣欣 馬博清 王 敬 宋光耀 高 哲 陳金虎 劉 晶
(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 石家莊 050051)
胰島素抵抗是2型糖尿病重要發(fā)病機(jī)制之一,大鼠高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型與人類肥胖時(shí)的胰島素抵抗、糖耐量異常相似。流行病學(xué)研究證實(shí),糖尿病患者體內(nèi)存在慢性低度炎癥反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子核因子(NF-κB)是炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵因子,游離脂肪酸、白介素-1β(IL-1β)等炎癥因子可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。NF-κB可能與胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)病有關(guān)。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物,是選擇性過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng)劑(PPAR-γ)。本研究旨在觀察高脂飲食大鼠胰腺組織NF-κB表達(dá)情況,并探索羅格列酮對(duì)胰島素抵抗的改善作用和抗凋亡作用及可能機(jī)制。
1.1 資料 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠(體重290~320 g)40只,河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。馬來(lái)酸羅格列酮,葛蘭素史克天津有限公司,4 mg/片,批號(hào):05060018。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物分組情況 隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)16只,高脂組(HF組)24只。NC組給予基礎(chǔ)飼料(碳水化合物占65.5%,脂肪占10.3%,蛋白質(zhì)占24.2%);HF組喂以高脂飼料(脂肪59.8%,碳水化合物20.1%,蛋白質(zhì)20.1%)。4 w后兩組各隨機(jī)選8只大鼠行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。HF組剩余16只大鼠隨機(jī)分為HF對(duì)照組和RSG組,每組8只。RSG組灌胃馬來(lái)酸羅格列酮蒸餾水混懸液3 mg·kg-1·d-1。
1.2.2 大鼠胰島素抵抗評(píng)估及動(dòng)物標(biāo)本取得 用高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)測(cè)定穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率來(lái)評(píng)估胰島素抵抗程度,3%戊巴比妥40 mg/kg麻醉大鼠,行右側(cè)頸動(dòng)脈及頸靜脈插管,繼續(xù)單籠喂養(yǎng),第3天禁食10 h,行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn),頸靜脈導(dǎo)管連接雙通道微量輸液泵,分別緩慢輸注胰島素和葡萄糖,血糖穩(wěn)定后以4 mU·kg-1·min-1的速率持續(xù)輸注胰島素,每10分鐘測(cè)血糖一次,根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速度,使大鼠血糖保持在(5±0.5)mmol/L的范圍至少30 min為達(dá)到穩(wěn)態(tài)。記錄穩(wěn)態(tài)下GIR平均值為胰島素敏感性指標(biāo)。鉗夾完畢大鼠留取血標(biāo)本,頸動(dòng)脈放血處死,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái),打開腹腔,取胰腺,放入液氮,-80℃冰箱保存。
1.2.3 血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定 空腹胰島素(FINS)測(cè)定用放射免疫法;鼠尾靜脈空腹血糖(FPG)測(cè)定采用Roche公司羅康全快速血糖儀;血脂測(cè)定采用酶法,美國(guó)產(chǎn)Beckman X20自動(dòng)生化分析儀;血清游離脂肪酸(FFA)采用銅顯色法測(cè)定。
1.2.4 Western印跡測(cè)胰腺組織NF-κB 從-80℃冰箱取胰腺組織,按凱基核蛋白及胞漿蛋白提取試劑盒裂解提取核蛋白,以考馬斯亮藍(lán)法用紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度,分裝-20℃保存。將提取的組織蛋白溶液與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混勻,煮沸5 min使蛋白變性。分別配制10%分離膠和5%濃縮膠。灌膠于1.5 mm厚的電泳板內(nèi)。每孔50 μg蛋白上樣,電泳。濕轉(zhuǎn)法將膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉1 h;三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TTBS)漂洗10 min×3,兔抗NF-κB p65多克隆抗體由Santa公司提供,以TTBS 1∶200稀釋后封閉,4℃ 5 h,取出PVDF膜,TTBS漂洗10 min×3,辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG TTBS 1∶1 000稀釋后封閉,常溫 1 h。取出PVDF膜,TTBS漂洗10 min×3,DAB顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。
1.2.5 TUNTL法測(cè)胰島組織凋亡 采用TUNEL技術(shù)檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡率。TUNEL試劑盒由德國(guó)寶靈曼公司提供。由兩位病理醫(yī)師分別閱片,凋亡細(xì)胞核染深棕色。將細(xì)胞核染為深棕色的細(xì)胞定為凋亡的胰島β細(xì)胞,每個(gè)胰島的細(xì)胞凋亡率(%)=β細(xì)胞凋亡數(shù)/β細(xì)胞總數(shù)×100%。每組大鼠取4張胰腺切片,每張切片中計(jì)數(shù)4個(gè)胰島。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)用±s表示,行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析,組間差異顯著時(shí)進(jìn)行兩兩比較q檢驗(yàn)。
2.1 各組生化指標(biāo)及GIR變化 見(jiàn)表1、表2。與NC組相比HF組第4周出現(xiàn)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA、FPG、FINS升高(P<0.05),GIR下降(P<0.05)。試驗(yàn)第8周HF組與 NC組相比 TC、TG、FFA、FPG、FINS繼續(xù)升高(P<0.05),GIR下降(P <0.05),RSG組與HF組相比TC、TG、FFA、FPG、FINS下降(P<0.05),GIR升高(P<0.05),RSG 組和 NC組之間 TC、TG、FFA、FPG、FINS及 GIR 無(wú)差別。
2.2 胰腺NF-κB表達(dá) 見(jiàn)圖1。Western印跡測(cè)得,HF組胰腺組織蛋白NF-κB含量較NC組升高,RSG組 NF-κB表達(dá)較HF組降低,NC組與RSG組之間無(wú)差異。
2.3 胰島β細(xì)胞凋亡情況 見(jiàn)圖2。HF組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)目較NC組增多,RGS組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)目較HF組降低,NC組與RSG組相比無(wú)明顯差異。
表1 第4周NC組和HF組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8,±s)
表1 第4周NC組和HF組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8,±s)
與NC組比較:1)P<0.05
組別 TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(mmol/L) FPG(mmol/L) FINS(mIU/L) GIR(mg·kg-1·min-1 NC組 0.78±0.11 0.59±0.10 0.56±0.21 4.47±0.36 12.87±5.19 28.50±5.21 HF組 0.92±0.101) 0.74±0.091) 1.29±0.31) 5.22±0.281) 19.67±3.961) 20.32±2.991))
表2 第8周NC組、HF組、RSG組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8,±s)
表2 第8周NC組、HF組、RSG組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8,±s)
與NC組比較:1)P<0.05;與HF組比較:2)P<0.05
組別 TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(mmol/L) FPG(mmol/L) FINS(mIU/L) GIR(mg·kg-1·min-1 4.36±4.71 29.06±4.99 HF 1.05±0.051) 0.77±0.061) 1.45±0.261) 5.53±0.421) 25.84±11.21) 18.54±3.891)RSG 0.79±0.062) 0.60±0.072) 1.09±0.262) 4.81±0.392) 13.56±2.092) 24.75±1.541)2))NC 0.83±0.05 0.55±0.10 0.70±0.31 4.52±0.42 1
圖1 第8周大鼠胰腺組織NF-κB表達(dá)
圖2 第8周胰島凋亡情況(×200)
胰島素抵抗是指胰島素靶組織對(duì)胰島素敏感性和反應(yīng)性下降,從而導(dǎo)致正常劑量的胰島素與特異性受體結(jié)合以后產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗模型與人類肥胖時(shí)的胰島素抵抗、糖耐量異常相似,尚具有可靠性高、簡(jiǎn)便、易行、價(jià)格相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)。高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)由De Fronzo 1979年創(chuàng)立,是目前世界上公認(rèn)的測(cè)定機(jī)體胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)。它以同時(shí)輸入外源胰島素及葡萄糖的方法避免了內(nèi)源性胰島素缺乏(如糖尿病病人)及低血糖(如胰島素耐量試驗(yàn))對(duì)胰島素敏感性測(cè)定的影響,本文采用清醒狀態(tài)的鉗夾術(shù),測(cè)定胰島素敏感性更接近于生理狀態(tài)〔1〕。
炎癥和2型糖尿病、胰島素抵抗有非常密切的關(guān)系。2型糖尿病患者有明顯的白細(xì)胞增加,在肥胖或2型糖尿病患者血漿中免疫球蛋白、TNF-α、IL-6等明顯增高。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是由多肽鏈p65和p50蛋白亞基構(gòu)成的二聚體。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí),NF-κB 位于細(xì)胞質(zhì)中,NF-κB 與 NF-κB 抑制蛋白(IκB)形成三聚體以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。外界信號(hào)通過(guò)不同途徑激活I(lǐng)κB激酶,即Iκk復(fù)合體,NF-κB得以激活,并移位進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA鏈上特異部位結(jié)合,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞功能的作用。Apiradee 等〔2〕研究表明,IκB/NF-κB 炎癥通路活化是骨骼肌胰島素抵抗的機(jī)制,他們發(fā)現(xiàn),IκBβ蛋白表達(dá)與鉗夾試驗(yàn)的葡萄糖輸注率正相關(guān),提示IκB/NF-κB炎癥通路與胰島素抵抗正相關(guān)。
本研究中,4 w的高脂喂養(yǎng)大鼠在高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)中GIR較正常喂養(yǎng)大鼠降低,表明高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠模型造模成功。FFA、TC、TG的升高支持了高脂喂養(yǎng)的作用,F(xiàn)PG升高、FINS升高與人類糖耐量減低及高胰島素血癥相似。8 w的高脂喂養(yǎng)大鼠蛋白印記證實(shí)胰腺組織NF-κB蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠體內(nèi)包括分泌胰島素的胰腺在內(nèi)已存在低度慢性炎癥反應(yīng),可能機(jī)制為高脂引起的NF-κB通路活化,激活了炎癥網(wǎng)絡(luò)。羅格列酮是近年來(lái)應(yīng)用的一種胰島素增敏劑,是核轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化酶體增殖物激活受體γ的配體,可提高肝臟、骨骼肌和脂肪等靶組織對(duì)胰島素的敏感性。本研究中羅格列酮可以降低高脂喂養(yǎng)大鼠的胰島素抵抗程度,其機(jī)制可能是通過(guò)阻斷NF-κB的激活來(lái)達(dá)到治療炎癥、改善胰島素抵抗的目的。臨床上常用的糖皮質(zhì)激素、阿司匹林及水楊酸鹽等均為NF-κB抑制劑。
凋亡不僅是1型糖尿病也是2型糖尿病胰島β細(xì)胞死亡的主要形式,由誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)催化產(chǎn)生的一氧化氮(NO)是細(xì)胞因子介導(dǎo)的β細(xì)胞損害及功能異常的潛在介質(zhì)。Holohan等〔3〕研究表明,誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生的一氧化氮與 IL-1β和干擾素-γ表達(dá)相關(guān),IL-1β和干擾素-γ介導(dǎo)的一氧化氮生成是β細(xì)胞凋亡的充分必要條件。本研究中,高脂喂養(yǎng)大鼠8 w胰島β細(xì)胞凋亡率升高,即在胰島素抵抗階段出現(xiàn)了胰島β細(xì)胞功能障礙,可能機(jī)制為一方面游離脂肪酸的脂毒性作用;另一方面,炎癥過(guò)程的關(guān)鍵核因子NF-κB的活化,啟動(dòng)了炎癥網(wǎng)絡(luò),損傷了胰島β細(xì)胞。羅格列酮干預(yù)可改善胰島β細(xì)胞凋亡水平,表明羅格列酮也具有改善β細(xì)胞功能的作用。
1 Kraegen EW,James DE,Bennet SP,et al.In vivo insulin sensitivity in the rat determined by euglycemic clamp〔J〕.Am J Physiol,1983;245:E1.
2 Apiradee Sriwijitkamol,Christine Christ-Roberts,Rachele Berria,et al.Reduced skeletal muscle inhibitor of κB β content is associated with insulin resistance in subjects with type 2 diabetes reversal by exercise training〔J〕.Diabetes,2006;55(3):760-7.
3 Holohan C,Szegezdi E,Ritter T,et al.Cytokine-induced beta-cell apoptosis is NO-dependent,mitochondria-mediated and inhibited by BCL-XL〔J〕.J Cell Mol Med,2008;12(2):591-606.