唐韻熙鄧放明

TANG Yun－xi1，2DENG Fang－ming1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

檸檬苦素類物質(zhì)是一類四環(huán)三萜類植物次生代謝物質(zhì)，主要存在于蕓香科和楝科植物組織中［1］，以果核中含量較高，果皮次之，果汁中含量最低。至今發(fā)現(xiàn)柑桔果實中較常見且含量較高的檸檬苦素類物質(zhì)主要有：檸檬苦素、諾米林、奧巴叩酮、脫乙酰諾米林等［2］。檸檬苦素類物質(zhì)有苷元和糖苷兩種存在形式，至今已從柑橘屬植物中分離出了37種類檸檬苦素苷元和17種類檸檬苦素糖苷［3］。類檸檬苦素苷元的結(jié)構(gòu)為D－環(huán)的C17位上連一個呋喃環(huán)，而且具有高度氧化的三萜醇類誘導(dǎo)體結(jié)構(gòu)，而糖苷是由檸檬苦素類似物苷元分子D環(huán)開環(huán)后在C17位上和一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合而成的［4］。國外對檸檬苦素類物質(zhì)的研究較為深入，據(jù)報道［5］，早在20世紀(jì)60年代，Arigoni和Barton就用化學(xué)和X－ray的方法對檸檬苦素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，指出檸檬苦素的分子式為C26H30O8，分子量為470。同時由于檸檬苦素類物質(zhì)的苷元和糖苷兩種結(jié)構(gòu)決定了其具有一定的健康維護(hù)功能，因此學(xué)者［6，7］對其進(jìn)行了分離、鑒定和生物活性探討。Murthy等［8］發(fā)現(xiàn)柑橘中檸檬苦素類物質(zhì)和姜黃素能夠抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。Archana等［9］用石油醚對Citrus medica Linn.種子進(jìn)行檸檬苦素類物質(zhì)提取，并以大白鼠為受體，研究表明，檸檬苦素類物質(zhì)能明顯降低大鼠體內(nèi)血清膽固醇、血清甘油三酯的含量，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL）含量，這有助于降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險。另有研究［10，11］指出檸檬苦素類物質(zhì)還有降血糖、殺蟲、抗病毒、抗腫瘤形成和抑菌等作用。

目前，對于檸檬苦素類似物的提取、分離、純化和鑒定已有一定的研究，常用的提取方法主要有超聲波輔助提取法［12］、溶劑提取法［13］、超臨界 CO2提取法［14］等。其常使用乙醇或丙醇等有機(jī)物作為提取劑，但使用量大且對環(huán)境有一定污染，特別是丙醇等毒性有機(jī)物。Deepak等［15］曾采用水溶助劑法對酸橘籽中具有生物活性的檸檬苦素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該方法可減少有機(jī)溶劑用量且提取率較好。本研究在此基礎(chǔ)上，選擇水楊酸鈉水溶助劑進(jìn)行提取，擬對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在找到一種環(huán)境友好型且提取率高的方法，為柑桔類水果的深加工提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

椪柑核：于湖南長沙水果市場采購椪柑并取籽，洗凈，50℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，保存于干燥環(huán)境中備用；

檸檬苦素標(biāo)樣：純度98%，成都曼思特生物科技有限公司；

水楊酸鈉、石油醚（60～90℃）、無水乙醇、濃硫酸、三氯化鐵、對二－甲氨基苯甲醛：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

顯色液（Ehrlich試劑）：A液：準(zhǔn)確稱取125mg對二－甲氨基苯甲醛溶于100mL的濃硫酸和乙醇混合液（濃硫酸65mL，乙醇35mL）中；B液：準(zhǔn)確稱取氯化鐵0.9g，用蒸溜水溶解并定容至100mL，使用時A液中加入0.5mL的B液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器

可見分光光度計：WFJ7200型，上海龍尼柯儀器有限公司；

高速中藥粉碎機(jī)：ZN－400A型，長沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW－S－4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－ⅢT型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子分析天平：AUY220型，日本Shmadzv公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 椪柑核檸檬苦素的測定

（1）檢測波長的確定：準(zhǔn)確稱取10mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用50mL無水乙醇溶解、定容，配制成200μg／mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中，加無水乙醇1mL，再加顯色液5mL，搖勻，于暗處靜置30min，然后在不同波長下測定吸光度，并以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，觀察到最大吸收峰波長在490nm處。

（2）檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中，并分別用無水乙醇稀釋至2mL，再分別加入5.0mL顯色液，搖均，暗處靜置30min。用無水乙醇作為空白參比，在490nm波長下測定吸光度。根據(jù)測得結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檸檬苦素標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y。最終得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.004 1x－0.097 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.993 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 The standard curve of Limonin

（3）檸檬苦素提取得率的計算：將椪柑核檸檬苦素提取液定容到50mL，準(zhǔn)確吸取0.1mL于10mL試管中，準(zhǔn)確加入1.9mL無水乙醇稀釋，再加入5mL顯色液，于490nm波長處檢測樣品液的吸光度，然后根據(jù)吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得檸檬苦素類似物濃度，最后計算待測樣品中檸檬苦素類似物的含量，其計算公式見式（1）。

式中：

R——椪柑核中檸檬苦素類似物含量，%；

V——樣品定容體積，mL；

C—— 測得的樣品濃度，μg／mL；

L——加入的樣品體積，mL；

M—— 樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 提取椪柑核中檸檬苦素類似物的操作方法

（1）椪柑核脫脂：稱取一定量椪柑核粉，按料液比1∶4（m∶V）倒入適量石油醚，密封好于室溫下浸提24h。而后抽濾自然干燥至無石油醚。

（2）水溶助劑提取檸檬苦素：稱取脫脂椪柑核粉2g（精確至0.000 1g）于100mL錐形瓶中，按料液比加入一定量的水溶助劑水楊酸鈉，于一定溫度下浸提一定時間，然后抽濾，用提取溶劑定容至50mL，即得椪柑核檸檬苦素提取液。

1.3.3 椪柑核檸檬苦素提取單因素試驗

（1）提取時間篩選試驗：稱取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，在濃度為2mol／L的水楊酸鈉20mL，溫度為40℃下，分別浸提2，4，6，8，10h后，抽濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測定吸光度，通過計算檸檬苦素類似物得率，觀察浸提時間對檸檬苦素類似物提取率的影響。

（2）提取劑濃度篩選試驗：稱取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，在40℃下提取6h，用濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mol／L的水楊酸鈉20mL進(jìn)行提取，待提取完后，抽濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測定吸光度，并計算得率，觀察提取劑濃度對檸檬苦素類似物溶出的影響。

（3）提取溫度篩選試驗：稱取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，用20mL濃度為2mol／L的水楊酸鈉，分別在20，30，40，50，60℃下浸提6h，過濾，加提取試劑定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測定吸光度，并計算得率，觀察提取溫度對檸檬苦素類似物提取率的影響。

（4）料液比篩選試驗：稱取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）加入濃度為2mol／L的水楊酸鈉，在40℃下浸提6h，過濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測定吸光度，并計算得率，觀察料液比對檸檬苦素類似物溶出的影響。

1.3.4 椪柑核檸檬苦素提取正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用提取時間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗，以檸檬苦素得率為指標(biāo)，確定最佳提取條件，并確定各因素的影響重要性次序。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間由2h延長到6h，檸檬苦素類物質(zhì)的提取率逐漸增大，提取6h后出現(xiàn)了緩慢下降的趨勢，這可能是由于浸提時間延長，溶劑中有效成分發(fā)生分解氧化現(xiàn)象從而降低了得率。因此，提取時間選取6h左右比較適宜。

圖2 提取時間對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響Figure2 Effects of extracting time on extraction yield of Limonin

2.2 提取劑濃度對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，隨著水楊酸鈉濃度由1mol／L增加到2mol／L，檸檬苦素類物質(zhì)的提取率呈上升趨勢，在2mol／L時達(dá)到最高。但在2mol／L以后，隨水楊酸鈉濃度升高，檸檬苦素類物質(zhì)的提取率稍有降低，這可能是因為其在2mol／L的水楊酸鈉內(nèi)已達(dá)到飽和，濃度過大反而影響檸檬苦素類似物的提取率。同時也考慮到水溶助劑濃度升高，會導(dǎo)致最終產(chǎn)品中非目標(biāo)成分的增加，影響目標(biāo)物純度，因此，提取溶劑濃度選取2mol／L左右比較適宜。

圖3 提取劑濃度對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響Figure3 Effects of extractant concentration on extraction yield of Limonin

2.3 提取溫度對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響

一般情況下，物質(zhì)在溶劑中的溶解度會因溫度的提高而增加，但檸檬苦素類物質(zhì)作為一種天然抗氧化物質(zhì)，在高溫條件下被氧化的概率也相應(yīng)增加，致使提取效率降低。由圖4可知，提取溫度從20℃提升到40℃，檸檬苦素類物質(zhì)的提取率呈上升趨勢，在40℃時達(dá)到最高。而后提取率有所下降，因此提取溫度選取40℃左右為宜。

圖4 提取溫度對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響Figure4 Effects of extracting temperature on extraction yield of Limonin

2.4 料液比對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響

溶劑用量的多少和檸檬苦素類物質(zhì)在其中的溶解率有一定的關(guān)系。由圖5可知，檸檬苦素的提取率是隨著料液比的提高而增加的。但是料液比到達(dá)1∶15（m∶V）后，上升趨勢不明顯，此時溶劑可能已經(jīng)將待提取物全部提取出。從節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本角度出發(fā)，選擇料液比1∶15（m∶V）左右為宜。

圖5 料液比對檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響Figure5 Effects of ratio of material to extractant on extraction yield of Limonin

2.5 正交試驗結(jié)果與分析

為了優(yōu)化椪柑核中檸檬苦素類似物提取條件，以檸檬苦素得率為指標(biāo)，選用提取時間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗因素進(jìn)行正交試驗，試驗因素水平取值見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2可知，用水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素類物質(zhì)的最佳條件為A2B2C2（C1）D3，即提取時間為6h，提取溶劑濃度為2mol／L，提取溫度為40℃（或30℃），料液比為1∶20（m∶V）。各因素對椪柑核中檸檬苦素類物質(zhì)提取率的影響依次為D＞B＞A＞C，即料液比＞提取劑濃度＞提取時間＞提取溫度。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Design of factors and levels for L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果表Table2 The result of L9（34）orthogonal test

表3 方差分析表?Table3 Analysis of variance table

由表3可知，不同料液比的試驗結(jié)果有顯著性影響。

依據(jù)正交試驗結(jié)果，在兩組最優(yōu)條件（即1：A2B2C2D3；2：A2B2C1D3）下進(jìn)行水溶助劑法提取椪柑核檸檬苦素重復(fù)實驗3次，兩組得到的檸檬苦素平均得率分別為4.21%，4.19%。因此，根據(jù)實際條件，最終選擇組1（A2B2C2D3）為最佳檸檬苦素提取條件。

3 結(jié)論

以椪柑核為原料，用水溶助劑水楊酸鈉為提取溶劑，研究椪柑核中檸檬苦素提取的優(yōu)化工藝條件。經(jīng)優(yōu)化后，水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素的最佳提取條件為提取時間6h、水楊酸鈉濃度2.0mol／L、溫度40 ℃、料液比1∶20（m∶V），在此條件下，椪柑核中檸檬苦素類物質(zhì)的提取率為4.21%。該方法也證實了前人對于水溶助劑提取檸檬苦素類似物可明顯減少有機(jī)溶劑用量的論證，且對環(huán)境的污染性小。但該方法只是采用椪柑核種子作為研究對象，在下一步的研究中，應(yīng)擴(kuò)大柑橘品種的選取面，針對果皮、果肉等不同部位進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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