孫 輝，高 萌，蔣 妮，鮑 旭，李 磊，李 鎮(zhèn)，田 燕

(1.解放軍210醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044;3.大連兒童醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001)

姜黃素PLGA-TPGS納米粒的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)

孫 輝1，高 萌2，蔣 妮3，鮑 旭2，李 磊2，李 鎮(zhèn)2，田 燕2

(1.解放軍210醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044;3.大連兒童醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001)

目的 制備姜黃素乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E納米粒(CM-PLGA-TPGS-NPs，簡(jiǎn)稱CPTN)并評(píng)價(jià)其質(zhì)量。方法 用自制的PLGA-TPGS為載體材料，采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備CPTN，通過粒徑、Zeta電位、載藥量、包封率和體外釋放度控制其質(zhì)量。采用RP-HPLC法，色譜柱為KROMASIL柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，用乙腈-2%冰醋酸溶液(58∶42)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm。結(jié)果 自制CPTN的平均粒徑為(197.9 ±6.2)nm，Zeta電位為( -22.3±1.8)mV，載藥量為(13.2 ±0.9)%和包封率為(79.3 ±1.6)%。體外姜黃素在含0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中呈兩相釋放，30 d時(shí)累積釋放率為91.3%。結(jié)論 CPTN質(zhì)量穩(wěn)定可控，體外試驗(yàn)顯示具有明顯的緩釋作用。

姜黃素;乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E;納米粒;RP-HPLC法;體外釋放度

姜黃素(curcumin，CM)是從姜科姜黃屬(Curuma L.)植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取出的一種天然有效成分，主要有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等多種藥理活性［1］，且不良反應(yīng)輕微，藥源充足，極具開發(fā)前景。近幾年來，對(duì)姜黃素抗腫瘤的藥理活性研究不斷增多，眾多的細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)均證明了姜黃素是一種發(fā)展前景良好的天然抗癌藥物［2］。但因其本身難溶于水，并且在堿性條件下不穩(wěn)定，口服生物利用度非常低。

納米粒(nanoparticles，NPs)用作藥物載體發(fā)展迅速，經(jīng)靜脈注射入血后能夠?qū)乃幬餄饧诟?、脾、骨髓等，降低了藥物在其他組織中的分布。納米粒的大小、表面電荷及其分布對(duì)藥物的靶向性具有非常重要的影響，尤其是主動(dòng)靶向到肝臟或肺部的納米粒［3］。因此，控制納米粒的粒徑和表面電荷，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟更好的靶向作用。維生素E-聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS)是維生素E的水溶性衍生物(也叫水溶性維生素E)，能通過抑制P蛋白改善細(xì)胞膜的滲透性，增強(qiáng)藥物的吸收，有效地抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，同時(shí)具有肝細(xì)胞特異性識(shí)別的作用［4］。市售材料乳酸羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)是一種生物可降解性合成高分子材料，由于其質(zhì)量穩(wěn)定、生物可降解和良好的可塑性，近年來被大量用作注射劑、納米粒等制劑的材料［5］。而本試驗(yàn)采用的是將TPGS和PLGA合成的新型材料——乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E(PLGA-TPGS)［6］作為載體制備納米粒，不但可通過控制納米粒的粒徑大小和表面電荷，實(shí)現(xiàn) CM對(duì)肝臟的被動(dòng)靶向作用，同時(shí)由于TPGS具有肝細(xì)胞特異性識(shí)別的作用，還可使CM納米粒具有對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性。

鑒于CM的疏水性較強(qiáng)，根據(jù)該藥本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，本試驗(yàn)用PLGA-TPGS為載體材料，采用超聲乳化 -溶劑揮發(fā)法［7］制備姜黃素納米粒(CM -PLGA -TPGS-NPs，簡(jiǎn)稱 CPTN)，通過粒徑、Zeta電位、載藥量和包封率控制其質(zhì)量，并與PLGA為載體制備的姜黃素-PLGA-納米粒(CMPLGA-NPs，簡(jiǎn)稱CPN)比較，考察二者的體外釋放度，以期尋找出粒徑適宜、載藥量合理以及體外藥物釋放理想的納米粒，為CPTN在體內(nèi)對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性等試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，并為制備CM新制劑提供試驗(yàn)依據(jù)，使其具有更大的開發(fā)和應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 儀器:1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷侖公司)，JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科技股份有限公司)，NanoZS90激光粒徑儀(英國(guó)Marlwern公司)，RW20數(shù)顯電動(dòng)攪拌機(jī)(日本IKA公司)，TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，冷凍干燥機(jī)FD-1C(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，HZQ-X100恒溫震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，F(xiàn)A1104I上皿電子天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.1.2 試藥:姜黃素原料藥(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度95%，批號(hào):20100513)，姜黃素對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，純度98%，批號(hào):20100302)，水溶性維生素E(維生素E-聚乙二醇1000琥珀酸酯，TPGS，美國(guó)Eastman化學(xué)公司)，乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E(PLGATPGS，自制，批號(hào):20101230)，乳酸羥基乙酸共聚物(polylactic - co - glycolic acid，PLGA，50∶50，MW 50，000，山東省醫(yī)療器械研究所，批號(hào):12090111)，乙酸乙酯(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20110610)，冰醋酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20090706)，甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司，批號(hào):907900)，氫氧化鈉(分析純，大連醫(yī)藥集團(tuán)化玻公司，批號(hào):20101030)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào):20100420)，十二烷基硫酸鈉(SDS，Sigma公司，批號(hào):L5750)。

1.2 方 法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:精密稱取姜黃素對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制成50 μg/mL的對(duì)照品溶液，在190～600 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)照品在波長(zhǎng)為410～450 nm的范圍內(nèi)均有較強(qiáng)吸收，在430 nm處吸收最強(qiáng)，而所用材料在此條件下無干擾，故選擇430 nm為吸收波長(zhǎng)。

圖1 紫外光譜圖A.姜黃素對(duì)照品;B.材料Fig 1 The ultraviolet spectrogramA.Curcumin reference substance;B.Auxiliary material

1.2.2 色譜條件［6］:色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠(KROM ASIL C18，5 μm，4.6 mm × 150 mm);流動(dòng)相:乙腈:2%冰醋酸(58∶42);檢測(cè)波長(zhǎng):430 nm;流速:1 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μL。精密量取姜黃素對(duì)照品5 mg和姜黃素納米粒適量(含姜黃素約5 mg)，分別至50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖2，姜黃素保留時(shí)間在7.8 min左右，分離度符合要求。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 Reversed-phase high performance liquid chromatography

1.2.3 姜黃素納米粒的制備:精密稱取姜黃素(CM)樣品20 mg 3份分別置10 mL離心管中，再精密稱取PLGA-TPGS 100 mg置上述離心管中，加入8 mL乙酸乙酯，充分放置使其全部溶解;量取0.06%TPGS水溶液100 mL 3份分別置250 mL燒杯中，冰水浴400W超聲條件下加入CM和PLGATPGS的乙酸乙酯溶液，超聲3 min，400 r/min電動(dòng)攪拌6 h，16 000 r/min高速離心15 min，洗3次，冷凍干燥24 h，得CPTN。同法制備用PLGA為載體的姜黃素 -PLGA - 納米粒(CPN，規(guī)格11.6 mg/g，批號(hào):20110312)

1.2.4 質(zhì)量評(píng)價(jià):(1)粒徑及zeta電位:稱取CPTN約2 mg加到4 mL蒸餾水中，超聲分散后形成納米?；鞈乙?，用激光粒度儀對(duì)其粒徑和粒徑分布進(jìn)行分析。將納米混懸液用蒸餾水稀釋后，再采用Zeta電位儀對(duì)納米粒表面Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。

(2)載藥量和包封率的測(cè)定:①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取姜黃素對(duì)照品25 mg置25 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使其溶解后，再加甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度為1 mg/mL對(duì)照貯備液。分別精密量取對(duì)照貯備液 50、100、200、400、800、1 600、3 200 μL置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容到刻度，搖勻，制成濃度分別為 5、10、20、40、80、160、320 μg/mL的系列對(duì)照溶液。按1.2.2色譜條件，取姜黃素系列對(duì)照液分別進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣量20 μL，以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=110.05C+129.49，r=0.9998，姜黃素在 5 ～320 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

②精密度試驗(yàn):精密吸取姜黃素對(duì)照貯備液100、400、1600 μL 各5 份，置 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，制成 10、40、160 μg/mL 的低、中、高3個(gè)濃度組，按1.2.4的(2)中①項(xiàng)下的方法連續(xù)測(cè)定5次和每天在同一時(shí)間進(jìn)樣、連續(xù)測(cè)定5 d，分別測(cè)定姜黃素對(duì)照貯備液的日內(nèi)精密度(RSD)和日間精密度(5 d)，結(jié)果日內(nèi)RSD分別為1.3%、1.2%、0.9%，日間 RSD 分別為 1.5%、1.3%、1.1%，取樣精密度良好。

③重復(fù)性試驗(yàn):取自制的同一批號(hào)的CPTN 5份，分別置25 mL離心管中，每份5 mg，用2 mL乙酸乙酯溶解后減壓揮發(fā)乙酸乙酯，加入25 mL流動(dòng)相渦旋混勻，按1.2.2色譜條件進(jìn)樣3次，每次20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果納米粒中CM含量的RSD為2.2%，該方法重復(fù)性好。

④相對(duì)回收率試驗(yàn):精密稱取自制的同一批號(hào)的CPTN 9份，分別置25 mL離心管中，每份5 mg，每3份分別精密加入1 mg/mL姜黃素對(duì)照貯備液100、200、300 μL，余下操作同 1.2.4 的(2)中③項(xiàng)下，于430 nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量，以測(cè)得量與加入量比較，計(jì)算回收率，結(jié)果CPTN中姜黃素平均相對(duì)回收率分別為100.4%(RSD=1.9%)，此法用于測(cè)定樣品含量的準(zhǔn)確度好。

⑤穩(wěn)定性試驗(yàn):取自制的同一批號(hào)CPTN 4 mg 3份，制備成 80 μg/mL濃度的樣品溶液，按 1.2.4的(2)中③項(xiàng)制備樣品溶液，測(cè)定 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h時(shí)的峰面積A，結(jié)果CPTN 4 mg在24 h內(nèi)的RSD 1.1%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

⑥載藥量和包封率的測(cè)定:取同一批號(hào)的自制的CPTN 5份，每份5 mg，分別置25 mL離心管中，用2 mL乙酸乙酯溶解后減壓揮發(fā)乙酸乙酯，加入16 mL流動(dòng)相渦旋混勻后16 000 r/min離心，按1.2.2色譜條件進(jìn)樣 3 次，每次 20 μL，測(cè)定峰面積A。

1.2.5 姜黃素釋放度的測(cè)定:取15 mg CM、CPTN及本教研室自制的CPN(CPTN、CPN的載藥量分別為13.3%、11.6%)，分別加入 5 mL 混溶有 0.5%SDS 的 PBS(pH7.4，取磷酸二氫鉀 1.36 g，加 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得)，形成藥物和納米?；鞈乙?，再放入透析袋(MWCO3500)中，置25 mL PBS 37℃120 r/min搖床中，于0.25、1、2、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27、30 d精取透析液20 mL(同時(shí)加入PBS 20 mL)，減壓蒸干，殘留物用10 mL流動(dòng)相溶解后16 000 r/min離心10 min，取上清液按1.2.2色譜條件測(cè)定CM含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其濃度和累積釋放量，并用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 粒徑及zeta電位

結(jié)果CPTN平均粒徑為(197.9±6.2)nm(n=3)，Zeta電位為(-22.3 ±1.8)mV(n=3)，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)=0.076。

2.2 載藥量和包封率的測(cè)定

結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品CPTN的載藥量為(13.2 ±0.9)%(n=5)、包封率為(79.3 ±1.6)%(n=5)。

2.3 姜黃素釋放度的測(cè)定

取6次試驗(yàn)的平均累積釋放率對(duì)時(shí)間作圖，繪制釋放曲線，結(jié)果見圖3，與CM原料藥相比，兩種CM納米粒具有顯著的緩釋作用。

圖3 兩種納米粒中CM和CM原料藥在PBS(pH7.4)中的累積釋放率曲線(n=6)Fig 3 Cumulative release rate in PBS(pH7.4)of CPTN，CPN and CM raw drug(n=6)

3 討論

CPTN和CPN的體外釋放均呈兩相釋放，前9 d藥物累積釋放率分別為66.2%和79.3%，屬于快速釋放;9 d后釋藥保持穩(wěn)定增長(zhǎng)，30 d時(shí)累積釋放率分別達(dá)到80.7%和91.3%，藥物為緩慢恒速釋放。1 d時(shí)為突釋階段，兩種納米粒的釋藥量不超過30%;擴(kuò)散階段納米粒釋藥持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，釋藥穩(wěn)定增長(zhǎng)，累積釋藥超過40%;降解階段納米粒中載體材料降解，釋藥達(dá)到80%以上，表明納米粒具有一定的緩釋作用。自制的載體材料PLGA-TPGS制備的姜黃素納米粒CPTN，具有比市售材料PLGA制備的CPN更大的體外累積釋放率，這為進(jìn)行體內(nèi)納米粒的吸收、分布、肝臟靶向性評(píng)價(jià)等試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

納米粒經(jīng)靜脈注射后，在體內(nèi)的分布首先取決于納米粒的粒徑大小。通常50～100 nm的微粒系統(tǒng)可以進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中;粒徑為100～200 nm的微粒很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的巨噬細(xì)胞從血液中清除，最終到達(dá)肝枯否細(xì)胞(Kupffer cell)溶酶體中;200～400 nm的納米粒集中于肝后迅速被肝清除。納米粒的靶向性還與微粒的表面電荷和疏水性質(zhì)有關(guān)，如表面帶負(fù)電荷的微粒易被肝臟攝取。微粒的粒徑及其表面的性質(zhì)決定了吸附哪種調(diào)理素及其吸附程度，同時(shí)決定了吞噬的途徑和機(jī)制［3］。本試驗(yàn)制備的CPTN平均粒徑為197.9 nm，Zeta電位為-22.3 mV，同時(shí)由于TPGS具有肝細(xì)胞特異性識(shí)別的作用及載體所帶電荷也為負(fù)性，更可提高納米粒對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向作用，以使CM能更好地發(fā)揮其抗肝炎和抗肝癌等作用。與CM原料藥相比，兩種CM納米粒具有顯著的緩解作用。這是由于在CM納米粒中，CM大量分布在兩種材料形成的網(wǎng)狀骨架中，藥物的釋放必須經(jīng)過網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)往外擴(kuò)散，故可延緩藥物的釋放。關(guān)于CPTN在體內(nèi)對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性等試驗(yàn)有待進(jìn)一步的研究。

采用RP-HPLC測(cè)定納米粒和體外釋放介質(zhì)中姜黃素的含量，操作簡(jiǎn)便，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。姜黃素在水中的溶解度極小，選用0.5%SDS水溶液做釋放介質(zhì)，能有效增加姜黃素的溶解度，且載體材料和釋放介質(zhì)對(duì)姜黃素的測(cè)定均無干擾。

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Preparation and quality evaluation of Curcuminloaded PLGA-TPGS Nanoparticles

SUN Hui1，GAO Meng2，JIANG Ni3，BAO Xu2，LI Lei2，LI Zhen2，TIAN Yan2
(1.Department of Pharmaceutics，No.210Hospital Branch of CPLA，Dalian116001，China;2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian116044，China;3.Department of Pharmaceutics，Dalian Children Hospital，Dalian116001，China)

［Abstract］ObjectiveTo prepare Curcumin-loaded polylactic-co-glycolic acid-D-α- tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate nanoparticles(CM -PLGA-TPGS-NPs，namely CPTN)and evaluate their quality.MethodsCPTN were prepared by ultrasonication emulsion/solvent evaporation technique using PLGA -TPGS made by ourselves，its mean size，Zeta potential，drug - loading，encapsulation efficiency andin vitrorelease rate of CPTN were determined.The condition was checked by RP -HPLC on KROM ASIL C18 column(4.6 mm ×250 mm，5 μm)with acetonitrile and 2%acetic acid(58∶42)as mobile phase，and the detective wavelength was 430 nm.ResultsCPTN was sphere-like with mean particle size of(197.9 ±6.2)nm，Zeta potential of(-22.3 ±1.8)mV，drug- loading of(13.2 ±0.9)%and encapsulation efficiency of(79.3 ± 1.6)%.Thein vitrodrug release profile in phosphate buffer solution of pH 7.4 containing 0.5%w/v Sodium dodecyl sulfate showed diphasic release pattern，the cumulative release rate was 91.3%at 30 d.ConclusionCPTN is stable and controllable in quality，in vitrorelease rate shows obvious sustained release.

［Key words］curcumin;PLGA -TPGS;nanoparticles;RP-HPLC;in vitrorelease rate

R965.3

A

1671-7295(2013)05-0438-04

孫輝，高萌，蔣妮，等.姜黃素PLGA-TPGS納米粒的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5):438-441.

10.11724/jdmu.2013.05.07

孫 輝(1977-)，女，遼寧沈陽人，主管藥師。E-mail:yyyyti@163.com

田 燕，教授。E-mail:tiany2004@126.com

2013-07-09;

2013-08-27)