李巍巍，任麗娜，張麗麗

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽 110001)

縫隙連接蛋白43在子癇前期患者胎盤組織中的表達及意義

李巍巍，任麗娜，張麗麗

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽 110001)

目的 探討縫隙連接蛋白43(Cx43)在子癇前期患者與正常妊娠婦女胎盤組織中的表達規(guī)律及其在子癇前期發(fā)病過程中可能的機制。方法 隨機選取子癇前期患者50例(輕度組20例，重度組30例)和正常妊娠孕婦50例(對照組)，應(yīng)用免疫組織化學法對3組胎盤Cx43的表達進行標記，通過彩色病理圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進行定量檢測并分析。結(jié)果 Cx43在子癇前期重度組表達低于輕度組及對照組，差異均有顯著性意義(P＜0.05);輕度組與對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。Cx43在胎盤組織的表達與妊娠期高血壓疾病病情嚴重程度呈負相關(guān) (r=-0.370，P＜0.05)。結(jié)論 子癇前期患者胎盤組織中縫隙連接蛋白Cx43的表達變化可能與子癇前期的發(fā)病機制有關(guān)。

子癇前期;縫隙連接蛋白43;胎盤

妊娠期高血壓疾病是妊娠期常見的并發(fā)癥，也是造成孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的常見原因之一。血管內(nèi)皮損傷是目前公認的妊娠期高血壓疾病的重要發(fā)病機理［1］，細胞間隙連接又稱縫隙連接，是普遍存在于人和動物組織中的一種細胞連接形式，而細胞間隙連接異常在妊娠期高血壓疾病內(nèi)皮損傷中起重要作用［2］。Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現(xiàn)存在于34種組織和46種細胞中［3］，Cx43表達及其縫隙連接功能的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程有密切的聯(lián)系［4］。目前，國內(nèi)外對Cx43與妊娠期高血壓疾病關(guān)系研究日漸增多，本研究采用SP法對胎盤組織進行免疫組化，分析Cx43的定位、分布和表達量，并與正常妊娠組進行比較，旨在探討Cx43與妊娠期高血壓疾病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2011年1月—2011年10月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的妊娠期高血壓疾病患者50例為疾病組，其中輕度子癇前期20例、重度子癇前期30例;妊娠期高血壓疾病的診斷標準參照第7版全國統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學》。以同期分娩的正常晚期妊娠孕婦50例為對照組。兩組年齡、孕周差異無顯著性意義，兩組孕婦均排除慢性高血壓、腎病、糖尿病及其他內(nèi)科合并癥。

1.2 標本采集

胎盤娩出后直視下剪取胎盤母體面中央1.0 cm×1.0 cm×0.6 cm大小無鈣化、無機化的胎盤組織，蒸餾水沖洗血液后，10%甲醛固定12 h，石蠟包埋待檢。

1.3 實驗方法

用免疫組化SP法進行染色，操作及方法按說明書進行。SP免疫組織化學檢測試劑盒、兔抗鼠Cx43多克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)公司，用前均釋成1∶80的工作液，4℃冰箱保存。取石蠟切片，置烤箱60℃ 2 h以使切片緊密粘附。二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，PBS洗，3 min×3次;檸檬酸鹽抗原修復液室溫孵育20 min;3%H2O2室溫孵10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;甩去多余液體，不洗;滴加兔抗鼠Cx43多克隆抗體，置37℃ 溫箱孵育1.5 h。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次;滴加生物素化羊抗兔IgG，置37℃ 溫箱孵育45 min;0.01 mol/L PBS洗2 min×3次;DAB顯色，蒸餾水洗滌;蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

(1)陽性表達:根據(jù)染色細胞所占的比例來判斷Cx43表達的陽性結(jié)果。在400放大倍數(shù)下，每張切片隨機選取10個視野，根據(jù)陽性染色強度分為淡黃色或黃色、棕黃色和深棕黃色;無論染色強度如何，陽性著色細胞比例≤10%為陰性、陽性著色細胞比例＞10%為陽性表達，計算陽性表達率 (陽性例數(shù)/例數(shù)×100%)。(2)陽性表達密度:采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件系統(tǒng)對Cx43染色結(jié)果進行分析。通過高倍顯微鏡采圖系統(tǒng)捕獲圖像，每張切片隨機采取胎盤組織10×20高倍視野圖像5個，測定不同區(qū)域陽性染色的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值作為每張切片細胞陽性表達的MOD值。所有切片均經(jīng)盲法分別由專人進行免疫組化染色及觀察評估。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

對照組和疾病組孕婦胎盤組織中Cx43的表達免疫組化染色顯示，疾病組胎盤Cx43主要表達在毛細血管內(nèi)皮細胞，對照組主要表達在絨毛合體滋養(yǎng)細胞和蛻膜組織中。疾病組中子癇前期輕度組胎盤Cx43染色陽性表達為8例，子癇前期重度組4例，正常妊娠對照組陽性表達為43例，妊娠期高血壓疾病組胎盤Cx43染色的陽性表達率明顯低于對照組(P＜0.05);子癇前期重度組明顯低于輕度子癇前期組(P＜0.05)。見表1、圖1～3。Cx43在胎盤組織的表達與妊娠期高血壓疾病病情嚴重程度呈負相關(guān) (r= -0.370，P ＜0.05)。

表1 疾病組與對照組胎盤Cx43表達平均光密度均數(shù)比較Tab 1 Comparison of OD of Cx43 expression in 3 sub groups

圖1 Cx43在對照組表達 (SP×100)Fig 1 Expression of Cx43 in the control group

3 討論

3.1 縫隙連接蛋白的生物學特性

圖2 Cx43在子癇前期輕度組表達(SP×100)Fig 2 Expression of Cx43 in mild pre-eclampasia group

圖3 Cx43在子癇前期重度組表達(SP×100)Fig 3 Expression of Cx43 in severe pre-eclampasia group

縫隙連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成的縫隙連接(gap junction，GJ)是相鄰細胞質(zhì)膜間的一種特殊跨膜蛋白通道結(jié)構(gòu)，可進行物質(zhì)和信息交換，參與離子和親水性小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。GJ的結(jié)構(gòu)單位為連接子(connexon)，是由6個結(jié)構(gòu)相同連接蛋白形成六聚體結(jié)構(gòu)，相鄰的細胞膜對應(yīng)面上的一對連接子組成GJ通道，可以使帶電離子和相對分子量＜1×103或直徑 ＜1.5 nm的小分子如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)等通過［5］。GJ 通過Cx結(jié)構(gòu)和功能的變化而導致的細胞間信號轉(zhuǎn)導異常，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤、視力和聽力障礙的發(fā)生密切相關(guān)［6］，Cx具有高度保守的氨基酸序列，不同Cx分子之間組合形成的縫隙連接通道的滲透性和導電性也有所不同，Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現(xiàn)存在于34種組織和46種細胞中［7］。在GJ介導的縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)方面發(fā)揮著重要的作用。

3.2 縫隙連接與細胞凋亡

縫隙連接是相鄰細胞間的唯一通道，它使細胞漿與相鄰的細胞相耦聯(lián)。它可以調(diào)節(jié)細胞的分化和發(fā)育。但是近年來研究表明它在細胞凋亡(apoptosis)和存活方面起著非常重要的作用［8］。GJ介導細胞凋亡可以通過以下2種途徑:(1)信號分子能夠通過相鄰的兩個細胞的GJ通道直接介導細胞凋亡;(2)構(gòu)成GJ的連接蛋白可以不依賴GJ通道而直接介導細胞凋亡。

3.3 妊娠期高血壓疾病與細胞凋亡

細胞凋亡是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細胞主動死亡過程，與個體的形成有著密切的關(guān)系。機體的正常發(fā)育有賴于細胞增殖與凋亡的平衡，胎盤是母體與胎兒的物質(zhì)交換器官，對妊娠的維持有著重要作用，胎盤細胞增殖、凋亡的平衡是胎盤發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，細胞凋亡失調(diào)將導致病理妊娠如妊娠期高血壓疾病。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠高血壓患者胎盤細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞、蛻膜細胞的凋亡數(shù)量均明顯高于正常妊娠組，說明細胞凋亡參與了胎盤的生長發(fā)育與代謝［9］。妊高征孕婦胎盤細胞凋亡顯著增加。DiFederico等［10］認為妊娠期高血壓疾病病理生理變化與細胞凋亡有關(guān)。

本研究免疫組化結(jié)果表明:妊娠期高血壓疾病組中子癇前期輕度組胎盤Cx43染色陽性表達為8例，子癇組4例，正常妊娠對照組陽性表達為43例，妊娠期高血壓疾病組胎盤Cx43染色的陽性表達率明顯低于正常妊娠組(P＜0.05)，子癇前期重度組明顯低于輕度子癇前期組(P＜0.05)。從實驗結(jié)果可知，在正常妊娠組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組患者胎盤組織中，Cx43的表達漸減少。近年來研究發(fā)現(xiàn)妊高征與胎盤凋亡異常有關(guān)。Cx43介導細胞凋亡［11］，而細胞凋亡失調(diào)將導致病理妊娠如妊娠期高血壓疾病。Cx43在妊娠期高血壓疾病患者胎盤中的表達明顯減少提示與胎盤免疫病理損傷即胎盤絨毛外滋養(yǎng)細胞凋亡有關(guān)，而胎盤免疫病理損傷程度與妊娠期高血壓疾病嚴重程度一致［10］，進一步說明妊娠期高血壓疾病患者胎盤Cx43表達減少是疾病加重的客觀指標。Cx43表達與妊娠期高血壓疾病病情嚴重程度呈負相關(guān)。

妊娠期高血壓疾病為妊娠期所特有的疾病，是造成圍產(chǎn)期孕婦和圍生兒死亡的主要原因，對妊娠期高血壓疾病的病因及發(fā)病機制的研究一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域的重要研究課題，本研究表明Cx43在胎盤組織的表達與妊娠期高血壓疾病病情嚴重程度呈負相關(guān)，通過對子癇前期患者胎盤縫隙連接蛋白Cx43進一步研究，對揭示子癇前期的發(fā)病機制可能起到一定的作用。

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Expression and significance of Connexin 43 in placenta tissue of pre-eclampsia

LI Wei- wei，REN Li- na，ZHANG Li- li
(Department of Obstetrics，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang110001，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of Connexin 43 in placenta tissue of preeclampsia and normal pregnant women，and to explore the etiology and mechanism of preeclampsia.Methods100 placentas tissues samples were obtained from 50 pre-eclampsia patients including 20 mild and 30 severe pre-eclampsia patients and 50 normal placentas tissues were enrolled from the third trimester pregnancies.Immunohistochemistry method was used to study the expression of Connexin 43 in placenta tissue Furthermore，multifunction precise color image measure system was used for quantitative analysis.ResultsThe expression of Connexin 43 in severe group was lower than that in mild group and normal group(P＜0.01).The expression in mild group was not lower than that in normal group(P＞0.05).Negative relationship between the expression of Connexin 43 in placenta tissue and severity of illness could be found with statistical significance(r=-0.370，P＜0.05).ConclusionPreeclampsia placenta tissue expression of Connexin 43 may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia.

［Key words］preeclampsia;Connexin 43;placenta

R714.7

A

1671-7295(2013)05-0430-04

李巍巍，任麗娜，張麗麗.縫隙連接蛋白43在子癇前期患者胎盤組織中的表達及意義［J］.大連醫(yī)科大學學報，2013，35(5):430 -433.

10.11724/jdmu.2013.05.05

遼寧省教育廳基金項目(L2010612)

李巍巍(1971-)，女，遼寧大連人，副教授。E-mail:liweiweileiyue3@hotmail.com

2013-05-31;

2013-07-16)