張 馳，娜荷雅，張幸竹，王絲墨，唐喜樂，馬振宇，肖 晶，李武偉

(大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

鼠胎膜修復(fù)大鼠腭裂的實驗研究

張 馳，娜荷雅，張幸竹，王絲墨，唐喜樂，馬振宇，肖 晶，李武偉

(大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

目的 以鼠胎膜對腭裂進行整復(fù)手術(shù)，研究修復(fù)腭裂的效果。方法 建立腭裂動物模型實驗。30只SD大鼠按照腭部裂隙大小分為3組，每組10只。a組:長7 mm×寬0.9 mm;b組:長7 mm×寬1.1 mm;c組:長7 mm×寬1.3 mm。術(shù)后12周處死所有大鼠，觀察裂隙變化。手術(shù)關(guān)閉裂隙實驗。10只SD大鼠分為3組。A組大鼠5只，手術(shù)造腭裂并以新鮮雙層胎膜關(guān)閉裂隙;B組大鼠3只，手術(shù)造腭裂，令裂隙自行生長;C組2只作為空白對照組。術(shù)后4周處死動物，大體觀察;制作切片，行組織學(xué)觀察。結(jié)果 腭裂動物模型成功建立，確立b組7 mm×1.1 mm為臨界缺損。A組大鼠腭裂得到成功修復(fù)，口鼻腔黏膜分別愈合，完全覆蓋腭裂，鏡下見腭裂處口腔黏膜層次清楚，存在黏膜下層，頂部有完整的鼻腔黏膜。結(jié)論 鼠胎膜對SD大鼠腭裂具有良好的修復(fù)效果。

腭裂;動物模型;腭裂整復(fù)術(shù);胎膜;大鼠

先天性腭裂是口腔頜面外科常見的發(fā)育畸形。由于腭部組織缺損導(dǎo)致口鼻腔相通，引起發(fā)音、吮吸、吞咽等功能障礙;同時，腭裂還影響頜骨的生長發(fā)育，常導(dǎo)致面中部塌陷和咬合關(guān)系錯亂［1］。近百年來，腭裂的整復(fù)治療主要是采用手術(shù)的方法，利用裂隙鄰近的黏骨膜組織瓣封閉裂隙，達到隔離口鼻腔的目的。但是，有時難以克服手術(shù)后創(chuàng)口裂開和瘢痕影響腭骨的生長發(fā)育等并發(fā)癥。因此，選用更好的方法對腭裂進行修復(fù)一直是研究的關(guān)注點。本研究使用同種異體鼠胎膜對大鼠手術(shù)造模腭裂進行了關(guān)閉裂隙的實驗，觀察其修復(fù)效果，以此為臨床腭裂患兒利用人羊膜進行整復(fù)治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

采用4周大SD雌性大鼠，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。體重120～150 g，共40只。隨機分為2組:(1)腭裂動物模型組:大鼠30只，按照不同造模裂隙大小分為3組，每組10只。a組:長7 mm × 寬0.9 mm;b組:長7 mm × 寬1.1 mm;c組:長7 mm×寬1.3 mm。(2)手術(shù)關(guān)閉裂隙組:大鼠10只，分為3組。A組:大鼠5只，手術(shù)造裂并關(guān)閉裂隙;B組:大鼠3只，手術(shù)造裂，令裂隙自行生長;C組:大鼠2只，空白對照組，不行任何手術(shù)。另備1只預(yù)產(chǎn)期為2～3 d后的SD孕鼠。

1.2 實驗器械和藥品

2.5%戊巴比妥鈉，1%和3%碘酊，PBS液，開口器，縫合線(4-0，8-0)，牙科臺式電機和慢速鉆，真空壓模成型器(日本)，透明成形塑料板等。

1.3 腭裂動物模型實驗

2.5%戊巴比妥鈉按20～30 mg/kg行大鼠腹腔內(nèi)麻醉，常規(guī)備皮，3%碘酊消毒。固定大鼠于手術(shù)臺上，開口器撐開口腔，1%碘酊消毒口腔。腭骨后緣起始，于腭部正中處由后向前做長7 mm，寬分別為0.9 mm、1.1 mm 和 1.3 mm 的長方形黏骨膜切口，用牙科臺式電機和慢速鉆在相應(yīng)范圍內(nèi)形成骨缺損［2-3］。生理鹽水加慶大霉素沖洗創(chuàng)面，壓迫止血。術(shù)后動物自由活動，每日肌注青霉素80萬單位，連續(xù)3 d。12周后處死3組所有大鼠，取腭部樣本，觀察裂隙的變化。

1.4 手術(shù)關(guān)閉裂隙實驗

1.4.1 大鼠胎膜制備:將孕鼠如前麻醉固定后，腹部備皮常規(guī)消毒，切開暴露腹腔，剪開子宮，摘除多個胚胎，剪取胎膜，PBS反復(fù)沖洗 3次，裁減成9 mm ×2.2 mm、9 mm ×2.6 mm、9 mm ×3.0 mm 大小的胎膜，置于慶大霉素生理鹽水中備用。

1.4.2 大鼠腭護板制備:術(shù)前以硅橡膠取大鼠腭部陰模灌注超硬石膏，以壓模成型器和透明成形塑料板制作腭護板，四角打孔后備用。

1.4.3 腭裂整復(fù)術(shù):A、B組大鼠如前準備和手術(shù)造裂，裂隙長7 mm×寬1.1 mm(圖1)。將裁減好的胎膜折疊成雙層，胚胎面朝外，8-0絲線無張力縫合固定于A組大鼠裂隙兩側(cè)口腔黏骨膜(圖2)。其上覆蓋腭護板，4-0絲線縫合亦固定于兩側(cè)黏骨膜上。B組大鼠僅造裂，C組大鼠不做處置。

術(shù)后如前護理，每日觀察大鼠的活動情況，至術(shù)后第7日時拆除A組大鼠腭護板。術(shù)后4周處死所有大鼠，腭部取材。10%中性福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，常規(guī)石蠟包埋。蘇木精-伊紅(HE)染色，中性膠封片，光鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 腭裂動物模型建立

全部大鼠成活，術(shù)后12周時3組大鼠的裂隙出現(xiàn)了不同的變化。a組裂隙長度、寬度變小，兩側(cè)黏骨膜向裂隙中央生長，未完全融合。去除黏骨膜后見骨板在裂隙前后兩端出現(xiàn)少量骨橋生長。b組裂隙黏骨膜未向中央生長，裂隙長度基本不變，寬度增加，裂隙前后兩端未見骨橋生長。c組裂隙存在，長度及寬度均明顯增加。采用Fisher四格表確切概率法對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，確定b組裂隙可以在術(shù)后12周時保持穩(wěn)定的裂隙寬度，符合實驗要求，為本研究的臨界缺損。見表1。

2.2 手術(shù)關(guān)閉裂隙組大體觀察

全部大鼠成活，未發(fā)現(xiàn)明顯排異反應(yīng)。術(shù)后4周時，A組大鼠裂隙被口鼻腔黏膜完全覆蓋，未見移植胎膜。裂隙中央表面黏膜略凹陷，光滑、完整，質(zhì)地與周圍黏膜一致，顏色略暗(圖3)。B組大鼠見裂隙存在，裂隙兩端骨板被口鼻腔黏膜融合生長后覆蓋。C組大鼠腭部黏膜完整、光滑，表現(xiàn)正常。

表1 術(shù)后12周時不同組別裂隙寬度的變化Tab 1 At the end of postoperative 12 weeks，the changes of cleft width in different groups

圖3 術(shù)后4周A組大體表現(xiàn)Fig 3 At 4 weeks，the gross appearance of group A

2.3 手術(shù)關(guān)閉裂隙組組織學(xué)觀察

A組大鼠腭部黏膜連續(xù)、完整，完全覆蓋裂隙，黏膜下層是較致密的膠原層，上方覆蓋鼻腔黏膜?？谇火つど掀哟吻逦?，細胞成熟，形態(tài)正常。上皮釘突明顯，排列整齊均勻。與兩側(cè)正常黏膜上皮形態(tài)基本一致(圖4)。

圖4 術(shù)后4周，A組腭部黏膜完全覆蓋裂隙(HE×100)Fig 4 At 4 weeks，the cleft was completely covered with normal mucosa in group A

B組大鼠腭部裂隙存在，口腔黏膜中斷，與鼻腔黏膜融合生長?？诒乔火つど掀哟吻逦毎墒?，形態(tài)正常(圖5)。C組大鼠腭部為正常表現(xiàn)，口鼻腔黏膜之間可見黏膜下層和完整的骨板(圖6)。A組與C組的口鼻腔黏膜組織學(xué)表現(xiàn)基本一致。

3 討 論

先天性唇腭裂動物模型的建立耗時、費用高，胚胎易發(fā)生流產(chǎn)不易存活，而且存在新生的腭裂動物喂養(yǎng)困難，形成的裂隙大小和解剖可變性大等諸多因素，因此選擇具有同一標準的先天性唇腭裂動物應(yīng)用于實驗研究面臨很大困難。迄今為止，尚未見到先天性唇腭裂動物模型用于整復(fù)研究的報道。

與先天性唇腭裂動物模型相比較，外科手術(shù)誘導(dǎo)的唇腭裂動物模型具有較高的一致性、可重復(fù)性和可適用性。因此，采用外科手術(shù)建立唇腭裂動物模型是一種既簡便又經(jīng)濟的方法，具有穩(wěn)定性好、數(shù)量可控、獲得時間短等明顯優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種唇腭裂修補術(shù)式和頜面發(fā)育等方面的研究［4-5］。本研究選擇了外科手術(shù)誘導(dǎo)的腭裂動物模型用于整復(fù)效果的研究，獲得了理想的結(jié)果。

臨界缺損(critical-sized defect)是指動物依靠自身修復(fù)不能恢復(fù)的最小缺損［6-7］。建立臨界缺損動物模型是研究組織缺損修復(fù)的前提條件。本組采用外科手術(shù)法獲得了腭部軟硬組織共同缺損的臨界缺損值，成功建立了腭裂動物模型。本研究確立的腭部臨界缺損可以應(yīng)用于今后的腭裂動物實驗研究中，如果想要進一步了解整復(fù)的效果，以增加腭部裂隙的寬度為宜。

利用裂隙旁黏骨膜瓣修補腭裂的外科手術(shù)一直是臨床治療的主要方法。但是，傳統(tǒng)的手術(shù)方法有許多缺陷:手術(shù)創(chuàng)傷大，分離裂隙旁的黏骨膜會破壞腭骨的血運，術(shù)后瘢痕影響腭骨的后天發(fā)育，從而影響頜面的整體發(fā)育;手術(shù)年齡一般在2歲左右，會影響患兒早期語音訓(xùn)練;裂隙較大時術(shù)后可能出現(xiàn)瘺或復(fù)裂。因此，本研究采用具有良好組織相容性的組織膜片來修復(fù)腭裂，避免了傳統(tǒng)手術(shù)方法的不足，獲得了穩(wěn)定、準確的關(guān)閉裂隙的效果。近年來，新型生物材料被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，為改進傳統(tǒng)腭裂手術(shù)提供了新希望［8-9］。本研究借鑒羊膜修復(fù)眼角膜潰瘍的成功經(jīng)驗，利用SD大鼠胎膜修復(fù)同種異體大鼠腭裂組織缺損，來探索一條治療腭裂的新路徑，為臨床修復(fù)人類腭裂提供實驗依據(jù)。鼠胎膜修復(fù)腭裂的研究，目前國內(nèi)外沒有報道。胎膜包含絨毛膜和羊膜，其中羊膜具有獨特的生物學(xué)特性:(1)抗炎、抗纖維化、抗新生血管作用:羊膜細胞能分泌多種抗體、多種溶菌酶、裂解體和補體，具有抗病毒和殺菌作用，從而抑制局部炎癥反應(yīng)，阻止新生血管和疤痕形成;(2)羊膜能分泌多種細胞因子，在傷口愈合中起重要作用——羊膜沒有免疫原性、含有多種有益生長因子，能夠促進創(chuàng)口的愈合，是天然的、良好的組織缺損修復(fù)材料。本實驗中未觀察到關(guān)閉裂隙A組動物出現(xiàn)明顯排異反應(yīng)，全部大鼠腭部均獲得完全愈合，組織學(xué)觀察口鼻腔黏膜形態(tài)、結(jié)構(gòu)與正常大鼠腭部組織結(jié)構(gòu)相似。而B組未能關(guān)閉裂隙，說明同種異體胎膜修復(fù)大鼠腭裂的手術(shù)是成功的。

本實驗結(jié)果提示，在人類腭裂的治療中也可以采用相似的方法。利用人羊膜來修復(fù)關(guān)閉裂隙也可獲得同樣滿意的效果［10-11］。如此則將改變目前臨床腭裂治療的許多限制，拓寬適應(yīng)癥的范圍;同時，較小的手術(shù)創(chuàng)傷對頜面骨的發(fā)育將減少到最小，可以降低后天畸形的發(fā)生率。

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［1］宋慶高，鄧金勇，陳尚，等.腭裂緣骨膜牽張成骨不同階段的組織學(xué)變化分析［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，38(2):141-149.

［2］王予江，童永青，戴群，等.早期植骨修復(fù)腭裂對上頜骨生長影響的實驗研究［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，2005，14(1):37-41.

［3］王奕，馬國武，仲維劍.自體骨碎末與復(fù)合移植修復(fù)種植體周圍骨缺損的比較研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2007，23(1):57-59.

［4］許悅，陳振琦，錢玉芬.外科誘導(dǎo)的唇腭裂動物模型［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，37(4):467-469.

［5］Khalid A，AL Ruhaimi.Closure of palatal defects without a surgical flap:an experimental study in rabbits［J］.J Oral Maxillofac Surg，2001，59(11):1319-1325.

［6］Schmitz JP，Hollinger JO.The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions［J］.Clin Orthop Relat Res，1986，205:299-308.

［7］Bardach J，Kelly KM.Role of animal models in experimental studies of craniofacial growth following cleft lip and palate repair［J］.Cleft Palate J，1988，25(2):103-113.

［8］Tseng SC，Prabhasawat P，Lee SH.Amniotic membrane transplantation for conjunctival surface reconstruction［J］.Am J Ophthalmol，1997，124(6):765-774.

［9］張葒，朱勤，胡竹林，等.新鮮多層羊膜移植治療細菌性角膜潰瘍的療效觀察［J］.臨床眼科雜志，2010，18(2):169-170.

［10］Kruse FE，Rohrschneider K，V?lcker HE.Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers［J］.Ophthalmology，1999，106(8):1504-1510.

［11］馬忠鋒，柴家科，楊紅明，等.表皮細胞膜片與豬去細胞真皮基質(zhì)復(fù)合的移植［J］.中華實驗外科雜志，2005，22(3):366-367.

Experimental study on cleft palate repair of rat using rat fetal membrane

ZHANG Chi，NA He-ya，ZHANG Xing-zhu，WANG Si-mo，TANG Xi-le，MA Zhen-yu，XIAO Jing，LI Wu-wei
(College of Stomatology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo explore the feasibility of repairing the defect in cleft palate using fetal membrane in a rat model.MethodsTo establish the animal model of cleft palate.Thirty SD rats were randomly divided into three groups with 10 rats in each group according to the different size of man-made cleft，group a:7 mm ×0.9 mm，group b:7 mm ×1.1 mm，group c:7 mm ×1.3 mm.Animals were sacrificed at the end of 12 weeks and the changes of clefts were compared.Repairing experiment for cleft palate.Ten SD rats were randomly divided into three groups，group A was underwent reduction with 5 rats，group B was only performed model operation with 3 rats，group C was blank with 2 rats.All rats were sacrificed at the end of 4 weeks and the gross and histological observation was respectively carried out.ResultsThe animal model of cleft palate was successfully established.Group b was determined to be the animal model group for critical-sized defect.Cleft palate was repaired successfully in group A with fetal membrane of rat，the structure of palate mucosa was similar to that of the group C in gross and histology.ConclusionThe tissue defect of cleft palate in a rat model can be repaired with rat fetal membrane，which is valuable for repairing human cleft palate in future.

［Key words］cleft palate;animal model;cleft palate repair;fetal membrane;rat

R656.21

A

1671-7295(2013)02-0135-04

張馳，娜荷雅，張幸竹，等.鼠胎膜修復(fù)大鼠腭裂的實驗研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，35(2):135-138.

10.11724/jdmu.2013.02.09

大連醫(yī)科大學(xué)第六屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品大賽立項(2012年6月)

張 馳(1989-)，女，貴州安順人，本科學(xué)生。

李武偉，副教授。E-mail:liwuweihong@yahoo.com.cn

2012-12-15;

2013-03-11)