陳 嬌 杜先鋒 王 瑤 韓 實(shí)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥 230036)

糯稻屬禾木科(Poaceae)稻屬(Oryza)，是稻的黏性變種，糯稻脫殼的米稱為糯米［1］。糯米的營養(yǎng)價(jià)值很高［2］，且糯米粉是制作黏性小吃，如元宵、年糕的主要原料。目前，糯米粉的制作多采用水磨(濕法)工藝［3］，該工藝中會(huì)產(chǎn)生大量廢水，其中含有部分水溶性蛋白質(zhì)，如不對其進(jìn)行回收利用，不僅會(huì)造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)，也會(huì)污染環(huán)境。企業(yè)通常采用的廢水處理系統(tǒng)會(huì)增加處理成本，加大企業(yè)負(fù)擔(dān)［4］。

本研究在不改變主產(chǎn)品糯米粉特性的基礎(chǔ)之上，根據(jù)酶解技術(shù)［5－7］改進(jìn)傳統(tǒng)水磨糯米粉生產(chǎn)工藝，對廢水進(jìn)行綜合利用。本工藝采用在浸泡步驟中加入蛋白酶的方法對所需要的酶解條件通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)，提高廢水中蛋白含量，并對糯米蛋白質(zhì)酶解后氨基酸成分加以研究，為糯米蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

糯米、糯米粉:安徽燕之坊食品有限公司;中性蛋白酶(酶活29.87×104U/g，):蘇州維邦生物科技有限公司;風(fēng)味蛋白酶(酶活573 LAPU/g):丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶(酶活80×104U/g)、堿性蛋白酶(酶活20×104U/g):廣西龐博生物工程公司;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液H型(17種氨基酸混合液):和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;氨基酸組分分析所用試劑為優(yōu)級(jí)純;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

JM－L80立式膠體磨:上海旺泉泵業(yè)有限公司;SHF－100板框壓濾機(jī):河南省新鄉(xiāng)市錦城環(huán)保設(shè)備有限公司;DF－101S磁力攪拌水浴鍋:鞏義市英峪予華儀器廠;SKD－200凱氏定氮儀:上海沛歐分析儀器有限公司;L－8900氨基酸自動(dòng)分析儀:日立公司;TA－XTplus物性測試儀:英國Stable公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液制備工藝流程

1.2.2 蛋白提取率的測定

式中:蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB/T5009.5—2010)，蛋白質(zhì)系數(shù)為 6.7。

1.2.3 酶解處理

糯米經(jīng)30℃水浸泡0.5 h，將浸泡水棄去，加入新水，經(jīng)立式膠體磨(0.01 mm的物料細(xì)度)，粉碎2次，調(diào)料液比1∶10，加入蛋白酶進(jìn)行水浴保溫處理，酶解液在沸水浴中加熱10 s滅酶終止反應(yīng)，過板框壓濾機(jī)得酶解液和糯米粉餅，粉餅經(jīng)粉碎干燥后得糯米粉。

1.2.4 酶的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)［8－10］，初步確定各酶粗略的酶解條件，見表1，按照1.2.3的酶解步驟進(jìn)行酶解，以蛋白提取率為指標(biāo)確定酶的種類。

表1 各酶酶解條件

1.2.5 糯米粉質(zhì)構(gòu)分析

樣品置于質(zhì)構(gòu)儀Back Extrusion Cell(A/BE)探頭下做質(zhì)構(gòu)特性試驗(yàn)。參數(shù)設(shè)置:測前速度為1.5 mm/s，測試速度為 2.0 mm/s，測后上行速度為 2.0 mm/s，測定距離為20.0 mm，觸發(fā)力為5 g，觸發(fā)類型為自動(dòng)，測試重復(fù)3次。

表征質(zhì)構(gòu)狀況的評(píng)價(jià)參數(shù):堅(jiān)實(shí)度用正峰的最大力代表;黏聚性用負(fù)峰的最大力來表示;稠度用正峰的峰面積表示;黏度指數(shù)用負(fù)峰的峰面積表示。正峰的力值和峰面積越大，說明凝膠爽滑性、細(xì)膩度越差;負(fù)峰的力值說明凝膠對探頭的附著性，一般較稠的凝膠粘性較大。

1.2.6 氨基酸組分分析

制備樣品:取750 μL待測樣品，加750 uL 4%的磺基水楊酸，置于冷凍離心機(jī)中在4℃、12 000 r/min條件下離心 15 min，取上清液 150 μL，加 750 μL 0.02 mol/L的HCl。微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液H型80 μL，用0.02 mol/L HCl定容到 2 mL，搖勻，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)

測定料液比、pH、溫度、加酶量及酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響，初步確定單一酶的適宜酶解條件。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)所確定的適宜酶解范圍內(nèi)，采用四因素二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以蛋白提取率為響應(yīng)值，通過考察4因素對酶解程度的協(xié)同影響來確定酶的較優(yōu)反應(yīng)條件。選取的因素與水平見表2。

表2 試驗(yàn)因素和水平對照表

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0分析軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的確定

由圖1可知，4種酶的蛋白提取率差異較大，風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶蛋白提取率在50%以下，不予考慮，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的提取率僅相差5%，考慮到堿性蛋白酶酶解過程中最適pH要調(diào)節(jié)到8.5，堿會(huì)造成氨基酸損失和淀粉糊化，對糯米粉質(zhì)構(gòu)影響較大，為不改變主產(chǎn)品糯米粉的性質(zhì)，因此選擇中性蛋白酶。

圖1 四種蛋白酶對糯米的酶解效果

2.2 中性蛋白酶酶解糯米的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間對糯米蛋白提取率的影響

用水浴攪拌法酶解4、5、6、7 h，所得蛋白提取率為56%～61%之間，差異不明顯，為了節(jié)約時(shí)間和能源，在后期試驗(yàn)中選取糯米漿水浴攪拌酶解4 h為佳。

圖2 酶解時(shí)間對糯米蛋白提取率的影響

2.2.2 料液比對糯米蛋白提取率的影響

由圖3可知，蛋白提取率隨料液比的變化趨勢是先升高后趨緩。在料液比較小時(shí)，水分活度較低，中性蛋白酶的活性被抑制，導(dǎo)致蛋白提取率較低。隨著料液比的增加，水分活度相應(yīng)增大，酶活性提高，蛋白提取率也在增大，在料液比為1∶12以后，水分活度過大，中性蛋白酶活性達(dá)到極限，蛋白提取率增加趨緩。在試驗(yàn)范圍內(nèi)料液比為1∶14時(shí)，蛋白提取率最好，為61.63%，但在料液比為1∶10時(shí)，蛋白提取率亦達(dá)到56.84%，后期試驗(yàn)中選取1∶10的料液比。

圖3 料液比對糯米蛋白提取率的影響

2.2.3 pH對糯米蛋白提取率的影響

由圖4可知，pH在6.0～6.5范圍時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高值，pH為7.0時(shí)，蛋白提取率顯著下降。因?yàn)榕疵诐{本身pH在6.5左右，所以選擇糯米漿本身pH即可，既節(jié)省人力物力，又減少對環(huán)境和主產(chǎn)品糯米粉的不良影響。

圖4 pH對糯米蛋白提取率的影響

2.2.4 溫度對糯米蛋白提取率的影響

由圖5可知，中性蛋白酶酶解糯米在50℃時(shí)蛋白提取率最高，50℃之后隨著溫度的繼續(xù)升高糯米蛋白提取率快速下降，在60℃，蛋白提取率只有34.05%，這說明隨著反應(yīng)溫度的提高，酶的活性降低，蛋白提取率下降。因此，選擇酶解溫度為50℃。

圖5 溫度對糯米蛋白提取率的影響

2.2.5 加酶量對糯米蛋白提取率的影響

由圖6可知，在酶促反應(yīng)中，底物的濃度已達(dá)到使酶飽和的狀態(tài)時(shí)，其反應(yīng)速度將隨酶濃度的變化而變化［11］。加酶量在5 000 U/g時(shí)，蛋白提取率最高，3 500～4 500 U/g的反應(yīng)體系中底物充足，速度較快，5 500 U/g以后趨緩，這時(shí)，酶與酶之間相互水解，使酶有效利用率下降，所以選擇中性蛋白酶用量5 000 U/g。

圖6 加酶量對糯米蛋白提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以對糯米蛋白提取率影響較大的加酶量(X1)、料液比(X2)、酶解溫度(X3)、時(shí)間(X4)為4個(gè)試驗(yàn)因素，以蛋白提取率為目標(biāo)，設(shè)計(jì)二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3。表3中酶解液1～4表示糯米蛋白提取率由高到低排序前4的酶解液。

響應(yīng)曲面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，運(yùn)用SAS 9.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4，得到二次多項(xiàng)回歸模型:Y=76.55 －1.62X1－0.66X2－0.62X3－0.94X4－1.55X12+0.61X1X2+0.66X1X3－0.83X2+0.64XX－0.88X2－0.90X42

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示模型的F 值 =13.75 ＞ F0.05(14，6)=2.85，P=0.000 1 ＜0.01，回歸模型顯著，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。R2=90.74%說明模型擬合度好，能夠很好的描述試驗(yàn)結(jié)果。一次項(xiàng)中 X1、X4影響極顯著;交互項(xiàng)中 X1X2、X1X3、X2X3影響顯著;二次項(xiàng)中X12、X22、X32、X42影響極顯著。通過軟件分析，并考慮實(shí)際操作的可行性，得出最佳酶解條件為:加酶量為4 000 U/g、料液比為1:9、溫度為40℃、時(shí)間為4.5 h。取30 g糯米經(jīng)30℃水浸泡0.5 h后，將浸泡水棄去，加入新水，經(jīng)立式膠體磨(調(diào)節(jié)到0.01mm的物料細(xì)度)，粉碎2次，調(diào)料液比為1:9，加入4 000 U/g中性蛋白酶，于40℃水浴攪拌4.5 h，板框壓濾機(jī)過濾后得糯米酶解液和糯米粉餅，糯米粉餅經(jīng)干燥后得糯米粉。在此最優(yōu)條件下，得糯米粉19.8 g(含蛋白質(zhì)0.41 g)，酶解液中糯米蛋白提取率為 78.75%，略高于響應(yīng)面預(yù)測值78.61%，證明響應(yīng)面法對糯米蛋白酶解條件的優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 糯米粉質(zhì)構(gòu)分析

最優(yōu)酶解條件制得的糯米粉保持傳統(tǒng)糯米粉的質(zhì)構(gòu)特性，其堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘聚性和粘度指數(shù)曲線與傳統(tǒng)水磨糯米粉基本一致，結(jié)果見圖8，說明本工藝制得的糯米粉能夠滿足制作元宵、年糕等傳統(tǒng)小吃對質(zhì)構(gòu)特性的需求。

圖7 不同工藝糯米粉的質(zhì)構(gòu)特性

2.5 糯米酶解液的氨基酸組分分析

食品中的氨基酸的種類和含量是衡量其營養(yǎng)質(zhì)量高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)［12］。糯米蛋白提取率最高的4種酶解液(工藝水平見表3)氨基酸組成成分見表5，除去試驗(yàn)儀器無法測出的色氨酸之外，含有17種氨基酸，酶解液3、4中分別缺少絲氨酸、天門冬氨酸。酶解液1、2氨基酸種類比較齊全，包括7種人體必需氨基酸(EAA)，和10種非必需氨基酸。酶解液1中必需氨基酸總量(ΣEAA)最高，且氨基酸總量(ΣAA)達(dá)到 511.09mg/100 mL，進(jìn)一步分析其氨基酸評(píng)分。一般認(rèn)為，蛋白中的 ΣEAA達(dá)到其ΣAA40%以上即為優(yōu)質(zhì)蛋白［13］。從表5中可知，酶解液 1～4中 ΣEAA分別為 50.36%、55.17%、54.12%、51.52%，均超過其 ΣAA 的50%，因此糯米蛋白酶解液為優(yōu)質(zhì)蛋白。

表5 不同酶解液中氨基酸組成與含量/mg/100 mL

由表6可知，糯米酶解液1中人體所需的EAA含量較高且全面，尤其是苯丙氨酸和酪氨酸含量顯著高于FAO/WHO評(píng)分模式中同種氨基酸的含量。

表6 酶解液1與FAO/WHO推薦模式及不同人群需要的氨基酸評(píng)分模式比較

3 結(jié)論

3.1 采用SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，在單因素酶解試驗(yàn)基礎(chǔ)之上進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立中性蛋白酶酶解糯米工藝中加酶量、料液比、酶解溫度和時(shí)間對蛋白提取率的數(shù)學(xué)模型。通過方差和可信度分析表明，模型擬合度較好。最優(yōu)酶解條件為:加酶量為4 000 U/g，料液比為1∶9，溫度為 40 ℃，時(shí)間為 4.5 h，蛋白提取率實(shí)際可達(dá)到78.75%。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，建立的蛋白提取率模型可以完全模擬中性蛋白酶酶解糯米蛋白的過程。

3.2 最優(yōu)酶解條件下制得的糯米粉保持傳統(tǒng)糯米粉的質(zhì)構(gòu)特性，其堅(jiān)實(shí)度、稠度、黏聚性和黏度指數(shù)曲線與傳統(tǒng)水磨糯米粉基本一致，說明本工藝制得的糯米粉能夠滿足制作元宵、年糕等傳統(tǒng)小吃對質(zhì)構(gòu)特性的需求。

3.3 通過對最優(yōu)酶解條件下的糯米酶解液進(jìn)行氨基酸組分分析可知，糯米酶解液含有17種氨基酸，包括7種人體必需氨基酸和10種非必需氨基酸，種類比較齊全，其中人體不能合成的必需氨基酸含量達(dá)到50.36%。糯米酶解液具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，可開發(fā)為飲料等產(chǎn)品。

［1］GB1354—2009 大米［S］

［2］王瑤.交聯(lián)酯化糯米淀粉的制備與性質(zhì)研究［D］.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008

［3］張業(yè)云.水磨糯米粉生產(chǎn)中若干問題的探討［J］.中國稻米，2004，(4):37 －38

［4］夏永紅，夏禹，劉清慧.淺談食品工業(yè)廢水處理［J］.現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2009，10:18 －21

［5］王文高，陳正行，姚惠源.不同蛋白酶提取大米蛋白質(zhì)的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2002(2):41－42

［6］劉彬，黃文，單麟軍，等.酶水解米渣蛋白的工藝研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2005，(8):6－8

［7］王溯，陳季旺，田向東，等.燕麥分離蛋白的酶改性及其制品理化性質(zhì)研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25(4):32－36

［8］吳姣，鄭為完，趙偉學(xué)，等.有限酶解米渣蛋白的乳化功能特性表征［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(10):23－26

［9］陽仲秋.米渣中蛋白質(zhì)的有效提取及其改性的研究［D］.長沙:中南林業(yè)科技大學(xué)，2010

［10］任東東.米渣蛋白提取改性及在高蛋白粉末油脂中的應(yīng)用［D］.南昌:南昌大學(xué)，2008

［11］劉兆芳，楊靜峰，董秀萍，等.河蟹肉酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，33(6):126－129

［12］Energy and protein requirements in human nutrition［R］.Geneva:World Health Organization，1973(WHO Technical Report Series，No.522):63

［13］Energy and protein requirements in human nutrition［R］.Geneva:World Health Organization，2002(WHO Technical Report Series，No.935):180