馬 驍， 王 建， 田 徽， 羅鳳娟， 黃 聰， 夏厚林

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137)

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd和卵葉遠(yuǎn)志 Polygala sibirica L．的干燥根。遠(yuǎn)志味苦、辛，性溫，主歸心腎經(jīng)［1］，具有寧心安神、化痰開竅的功效，主治心神不寧證、癲癇驚狂及咳嗽痰多，為臨床常用藥。課題組的前期研究結(jié)果顯示:單味遠(yuǎn)志具有抑制胃腸動力的副作用，同時對胃腸黏膜有一定損傷［2-3］。通過對厚樸配伍遠(yuǎn)志的研究發(fā)現(xiàn):在遠(yuǎn)志中加入厚樸后，遠(yuǎn)志的胃腸動力障礙及對胃黏膜的損傷得到了有效的抑制，同時也保存了遠(yuǎn)志寧心安神、化痰開竅的功效，尤以遠(yuǎn)志與厚樸比例為1∶2時效果最佳［4］。

遠(yuǎn)志傳統(tǒng)的炮制方法繁多，主要有凈制、炒制、蜜炙、甘草炙、姜汁炙、酒制、麩制、朱砂制，對遠(yuǎn)志炮制品的藥理、化學(xué)研究因此也更多集中在蜜炙、甘草炙、姜汁炙等方面。課題組結(jié)合厚樸配伍遠(yuǎn)志的研究結(jié)果，通過采用7因素3水平正交試驗(yàn)表，選取A(遠(yuǎn)志厚樸比例1∶1～1∶3)、B(厚樸煎汁時間5～15 min)、C(厚樸汁濃縮體積10～40 mL)、D(炒炙溫度60～120℃)、E(炒炙時間6～12 min)、F(炙遠(yuǎn)志煎煮時間20～60 min)此6因素3水平為考察對象，結(jié)合胃殘留腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，篩選出了厚樸汁炙遠(yuǎn)志的減毒增效的最佳工藝及煎煮方法，并通過鎮(zhèn)靜、自主活動、止咳、祛痰等相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究，證明了優(yōu)選出的炮制品藥效穩(wěn)定。同時，運(yùn)用化學(xué)成分分析，初步考察了遠(yuǎn)志炮制品的指標(biāo)性成分的變化。

1 儀器與試藥

Shimazdu LC—20AT高效液相色譜儀，N2000色譜工作站，BP211D電子分析天平，GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)，KQ—600 DE型數(shù)控超聲波清洗器 (40 kHz，600 W，昆山市超聲儀器有限公司)。甲醇為分析純、色譜純，水為樂百氏純凈水，其他試劑均為分析純。

遠(yuǎn)志及厚樸藥材均購于成都市西南藥都中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定厚樸為厚樸Magnolia officinalis Rehd．et Wils．的根皮，遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia willd的根，均為2010年版《中國藥典》收載品種。經(jīng)測定，遠(yuǎn)志藥材中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量大于2.0%，厚樸藥材中和厚樸酚及厚樸酚總量大于1.6%。符合《中國藥典》要求。

和厚樸酚、厚樸酚與細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-11050601、MUST-11050602、 MUST-11042801， 經(jīng)面積歸一化法計(jì)算，純度均大于98.0%，可做對照品使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ①測定和厚樸酚及厚樸酚為Boston Green C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);甲醇-水 (78 ∶22)為流動相;體積流量 1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長為294 nm。分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算不低于3 800。②測定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為Boston Green C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);甲醇-0.05%磷酸溶液 (55∶45)為流動相;體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長為210nm。分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰計(jì)算不低于3 000。對照品及樣品HPLC圖譜見圖1、圖2。

圖1 和厚樸酚、厚樸酚對照品和藥液樣品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram s of honokiol，magnolol standards and samples

圖2 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品和藥液樣品HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram s of tenuifolin standard and samples

2.2 炮制品、單味遠(yuǎn)志、單味厚樸藥液的制備①炮制品藥液:依據(jù)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出能降低胃腸動力障礙，又能保存鎮(zhèn)靜、祛痰鎮(zhèn)咳功效的炮制品。將遠(yuǎn)志炮制品中加10倍量水浸泡30 min后，武火煮沸，文火煎煮20 min。將藥液減壓濃縮至50 mL，定容至100 mL，濃縮為含生藥為1.5 g/mL的藥液。②遠(yuǎn)志藥液:10倍量水浸泡50 g遠(yuǎn)志生藥材30 min，武火煮沸，文火煎煮20 min。將藥液減壓濃縮至50 mL，定容至100 mL，濃縮為含生藥為0.5 g/mL的藥液。③厚樸藥液:10倍量水浸泡100 g厚樸生藥材30 min，武火煮沸，文火煎煮10 min。將藥液減壓濃縮至50 mL，定容至100 mL，濃縮為含生藥為1.0 g/mL的藥液。

2.3 測定酚性物質(zhì)的供試品的制備 取精密量取遠(yuǎn)志藥液、厚樸藥液、炮制品藥液各2 mL，加甲醇定容至10 mL量瓶中，振搖，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.4 測定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的供試品的制備 吸取經(jīng)過靜置的厚樸藥液、遠(yuǎn)志藥液、炮制品各上清液，3 000 r/min離心10 min后，精密量取各離心后藥液5 mL，加入質(zhì)量濃度為0.11 g/mL的氫氧化鈉溶液50 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.10 g/mL氫氧化鈉溶液55 mL，加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4～5，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.5 對照品的制備 ①取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇混合制成每1 mL含厚樸酚40μg、和厚樸酚24μg的溶液，即得。②取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.6 陰性干擾試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下遠(yuǎn)志供試品10 μL，依照2.1項(xiàng)下①的色譜條件進(jìn)樣，檢測，未發(fā)現(xiàn)干擾。取2.4項(xiàng)下厚樸供試品10μL，依照2.1項(xiàng)下②的色譜條件進(jìn)樣，檢測，未發(fā)現(xiàn)干擾。

2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取2.5項(xiàng)下①對照品2、4、6、8、10、12、18μL及質(zhì)量濃度為每1 mL含和厚樸酚48μg、厚樸酚80μg的混合對照品10 μL進(jìn)樣，測定;精密吸取2.5項(xiàng)下②細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品 2、4、6、8、10、12、16μL進(jìn)樣，測定。記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，見表1。

表1 和厚樸酚、厚樸酚及細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷線性關(guān)系和范圍Tab.1 Linearities and ranges of honokiol，magnolol and tenuifolin

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.5項(xiàng)下和厚樸酚、厚樸酚混合對照品、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品10μL，分別按照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。和厚樸酚、厚樸酚、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積RSD分別為1.20%、0.86%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法，平行制備6份厚樸供試品，按2.1項(xiàng)下①色譜條件，進(jìn)樣10μL。測得厚樸藥液中和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD分別為2.89%、2.22%;按照2.4項(xiàng)下供試品制備方法，平行制備6份遠(yuǎn)志供試品，按2.1項(xiàng)下②色譜條件，進(jìn)樣10μL。測得遠(yuǎn)志藥液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積的RSD為2.44%。表明分析厚樸、遠(yuǎn)志藥液中指標(biāo)成分的方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取2.3項(xiàng)下厚樸供試品，2.4項(xiàng)下遠(yuǎn)志供試品，2.5項(xiàng)下和厚樸酚、厚樸酚混合對照品及細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10μL。測得厚樸供試品中和厚樸酚、厚樸酚的峰面積RSD分別為0.36%、1.56%，和厚樸酚及厚樸酚混合對照品中和厚樸酚、厚樸酚的峰面積RSD分別為1.58%、1.62%;測得遠(yuǎn)志供試品、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的峰面積RSD分別為0.76%、1.32%。表明在室溫條件下，供試品、對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 平行精密量取6份厚樸水煎液2 mL，加入和厚樸酚及厚樸酚混合對照品適量，按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備，按照2.1項(xiàng)下色譜條件①進(jìn)樣10μL。計(jì)算各對照品的平均加樣回收率及RSD，見表2。和厚樸酚、厚樸酚平均回收率在96.70%～100.52%，RSD均小于2%。

平行精密量取6份遠(yuǎn)志水煎液5 mL，加入細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品適量，按照2.4項(xiàng)下供試品制備方法制備，按照2.1項(xiàng)下色譜條件②進(jìn)樣10μL。計(jì)算各對照品的平均加樣回收率及RSD，見表2。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷平均回收率為101.88%，RSD為2.79%。

2.12 樣品測定 取2.3、2.4項(xiàng)下各供試品，分別按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算和厚樸酚、厚樸酚及細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷量，結(jié)果見表3。

3 討論

遠(yuǎn)志能安神益智、祛痰開竅、消散癰腫，同時也有“令人悶”胃腸道副反應(yīng)。厚樸作為行氣消脹要藥，其功效燥濕行氣、化痰平喘，對于胃腸氣滯、脹滿有確切的療效，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)厚樸也有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，兩者配伍既可以降低遠(yuǎn)志的不良反應(yīng)，又可以增強(qiáng)遠(yuǎn)志的功效，尤以遠(yuǎn)志與厚樸比例為1∶2時，效果最佳。但此種配伍鮮有，因此這個配伍方式較難以影響臨床醫(yī)生應(yīng)用非常規(guī)的此種藥對。將厚樸炙遠(yuǎn)志做成飲片之后，能更直接的便于醫(yī)生及患者接受，可以更好的服務(wù)于臨床。

表2 和厚樸酚、厚樸酚、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的加樣回收率(n=6)Tab.2 Results of recovery tests of honokiol，magnolol and tenuifolin(n=6)

表3 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Determination results of decoction samples(n=3)

本實(shí)驗(yàn)基于2010年版《中國藥典》厚樸藥材、遠(yuǎn)志藥材定量測量的制備方法及色譜條件，通過改進(jìn)，確立了可靠的定量測定方法，檢測了各藥液中和厚樸酚、厚樸酚及細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的量。遠(yuǎn)志總皂苷為遠(yuǎn)志發(fā)揮藥效的有效部位，同時也是造成遠(yuǎn)志胃腸動力障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。其在堿水解的情況下，能全部轉(zhuǎn)化為細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷［6］。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷作為衡量遠(yuǎn)志的指標(biāo)性成分，旨在反映遠(yuǎn)志中有效部位總皂苷的量。和厚樸酚及厚樸酚作為厚樸的活性成分，具有廣泛的藥理作用，是厚樸的有效成分和指標(biāo)性成分［7-8］。

本課題組前期藥理實(shí)驗(yàn)已篩選出能減毒增效的厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品。研究結(jié)果顯示，炮制品的酚性成分與平行考察的單味厚樸藥液比較，酚性物質(zhì)略有降低;而炮制品的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷與單味遠(yuǎn)志藥液比較略有升高，但均無顯著差異。提示炮制品對厚樸、遠(yuǎn)志的指標(biāo)性成分無明顯干預(yù)，其指標(biāo)性成分均得以保留。這與課題組前期開展的體外實(shí)驗(yàn)研究所得結(jié)果相符合［9］。炮制品中厚樸酚性的量略有降低，可能與厚樸汁液濃縮、炒炙等炮制過程中所產(chǎn)生的損耗有關(guān)。炮制品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的量略有升高，也許與厚樸炙炒制過程增加其溶出有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)初步提示，厚樸汁炙遠(yuǎn)志后指標(biāo)性成分略有變化，但不顯著，表明炮制對有效部位干預(yù)不顯著，并使其得以保留。

本實(shí)驗(yàn)僅僅考查了炮制對指標(biāo)性成分的影響，而炮制對兩味藥所含的其他化學(xué)成分有無影響，指標(biāo)性成分之間的構(gòu)成比怎樣，有待采用指紋圖譜或液汁聯(lián)用等技術(shù)加以闡釋。再者，藥物擁有的物質(zhì)基礎(chǔ) (所含化學(xué)成分)，必須作用于生物機(jī)體后才能產(chǎn)生效應(yīng)。生物機(jī)體極其復(fù)雜，要闡明厚樸汁炙遠(yuǎn)志的物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律，單憑指標(biāo)成分定量測定遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。故要揭示炮制后對厚樸與遠(yuǎn)志所含指標(biāo)性成分的影響，尚需結(jié)合藥代動力學(xué)研究技術(shù)開展深入研究。

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