于大永， 時貞頌， 史麗穎， 馮寶民， 王永奇

(大連大學(xué)藥物研究所，遼寧大連116622)

金花茶Camellia chrysantha(Hu)Tuyama系山茶科Theaceae山茶屬Camellia植物，集中分布在中國廣西壯族自治區(qū)的西南部以及廣西壯族自治區(qū)與越南接壤的區(qū)域［1］。金花茶的葉主要用于咽喉炎，痢疾，腎炎，水腫，尿路感染，黃疸性肝炎，肝硬化腹水，高血壓，預(yù)防腫瘤等。金花茶花主要用于便血、月經(jīng)不調(diào)［2-3］。早期金花茶研究熱點主要集中在對金花茶植物形態(tài)學(xué)、植物分類學(xué)等方面的報道。而近年來對金花茶活性及功能因子的研究表明，金花茶具有抗氧化、降血脂、抗肝癌前病變等活性［4-6］。本課題組在以前的研究中報道了金花茶種子可以抑制腫瘤細胞增殖［7］，現(xiàn)在繼續(xù)對金花茶植物各部位抗腫瘤活性進行研究。

1 材料和方法

1.1 金花茶種子的提取 金花茶種子、花和葉采集于廣西南寧，由廣西林業(yè)科學(xué)研究院高級工程師梁盛業(yè)鑒定。金花茶種子、花和葉用95%乙醇提取并濃縮，得到金花茶種子95%乙醇提取物、葉95%乙醇提取物和花95%乙醇提取物。金花茶葉用蒸餾水提取并濃縮，得到金花茶葉水提取物。實驗前將上述各浸膏用DMSO分別配成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的樣品。然后將各個樣品用無血清培養(yǎng)基配成50、100、200、500、1 000、2 000μg/mL的藥物原液，并用0.22μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱備用。

1.2 細胞培養(yǎng) 人單核細胞白血病細胞株U937和人結(jié)腸癌細胞HCT116，常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)液用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時加入鏈霉素和青霉素，使雙抗在培養(yǎng)液中的濃度為100 U/mL，于37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。視具體情況換培養(yǎng)液，每2～3天傳代培養(yǎng)，使細胞保持在對數(shù)生長期。

1.3 體外細胞增殖抑制實驗 選擇生長狀態(tài)較好，處于對數(shù)期的細胞，用含有10%熱滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將U937和HCT116細胞制成懸液并調(diào)密度至1×105/m L，取96孔平底培養(yǎng)板，各孔加入180μL細胞懸液。細胞貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物原液20 μL，實驗組設(shè)6個藥物質(zhì)量濃度組，每組藥物的終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200μg/mL。其中藥物質(zhì)量濃度為200μg/mL時含二甲基亞砜 (DMSO)量最高，為0.2%，因此設(shè)空白對照和含0.2%DMSO對照。每個樣品重復(fù)3孔。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，孵育24 h，各孔加入MTT溶液 (5 mg/mL)20μL，同樣條件繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)。棄上清液，每孔加入150μL DMSO，(40℃恒溫培養(yǎng)箱中放置使結(jié)晶物充分溶解)。選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔OD值，計算體外細胞存活率。細胞存活率=(藥物孔OD值/對照孔OD值) ×100%。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果以均值±標準差表示，采用統(tǒng)計學(xué)t檢驗進行組間比較分析，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 金花茶花的抗腫瘤活性 用金花茶花95%乙醇提取物處理HCT116細胞和U937細胞，結(jié)果 (表1)發(fā)現(xiàn)20 μg/mL金花茶花乙醇提取物對HCT116細胞增殖就開始有抑制作用，并且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，細胞存活率逐步下降提高，且與對照組有顯著差異 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶花乙醇提取物從50μg/mL開始對U937細胞增殖有抑制作用，并且也表現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系。另外含0.2%的DMSO的樣品與空白對照相比沒有差異 (數(shù)據(jù)未列出)。經(jīng)過計算金花茶花95%乙醇提取物抑制HCT116和U937細胞的IC50分別為48.48μg/mL和211.71μg/mL。

表1 金花茶花95%乙醇提取物對U937細胞和HCT116細胞增殖的影響

2.2 金花茶種子的抗腫瘤活性 考察了不同質(zhì)量濃度金花茶種子95%乙醇提取物對U937和HCT116細胞增殖的影響。從表2可以看到5μg/mL金花茶種子乙醇提取物對U937就開始有抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各質(zhì)量濃度組與對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。而金花茶種子乙醇提取物抑制HCT116細胞增殖的質(zhì)量濃度范圍為50～200μg/mL，與對照相比有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶種子95%乙醇提取物抑制U937和HCT116細胞增殖的IC50分別為37.48μg/mL和94.17μg/mL。

表2 金花茶種子95%乙醇提取物對U937細胞和HCT116細胞增殖的影響

2.3 金花茶葉子的抗腫瘤活性 對金花茶葉乙醇提取物和水提取抑制腫瘤細胞增殖的活性進行了評價。從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)金花茶葉不同提取物都有很強的抑制U937細胞增殖的作用 (表3)。其中葉乙醇提取物抑制U937細胞增殖的質(zhì)量濃度范圍為20～200μg/mL，水提取的抑制質(zhì)量濃度范圍為50～200μg/mL，并且細胞存活率隨樣品質(zhì)量濃度的加大而降低 (與對照組相比，P＜0.05或P＜0.01)。金花茶葉乙醇提取物和水提取抑制U937細胞增殖的IC50分別為149.19 μg/mL和162.96μg/mL。而金花茶葉子的不同提取物對HCT116細胞增殖影響很小，結(jié)果表明沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 金花茶葉不同提取物對U937細胞和HCT116細胞增殖的影響

3 討論

本研究旨在探討金花茶不同植物部位對人白血病和結(jié)腸癌細胞株的抑制作用。在以前的研究中，金花茶葉是主要的藥用部位，富含氨基酸、茶皂苷、黃酮類及多種微量元素［8-9］。具有降血脂、降壓和抗癌防癌等方面的功能［5，10-12］。為此，本實驗對金花茶不同植物部位抑制腫瘤細胞的活性進行了考察。在研究中發(fā)現(xiàn)金花茶花抑制HCT116和U937細胞的IC50分別為48.48μg/m L和211.71 μg/mL，金花茶花抑制人結(jié)腸癌細胞的作用更為明顯。金花茶種子顯示了較強的抑制U937和HCT116細胞增殖的活性，其IC50分別為37.48μg/mL和94.17μg/mL，金花茶種子抑制U937細胞增殖作用更為明顯。而金花茶葉子不同提取物對U937細胞增殖有明顯的抑制作用，但是對HCT116細胞增殖抑制作用不明顯。本研究表明，金花茶花、種子和葉子均有抑制腫瘤細胞增殖的作用，在不同的腫瘤細胞中表現(xiàn)不同。而且與傳統(tǒng)的金花茶葉作為藥用部位相比，其花和種子有著更為顯著地抑制腫瘤細胞的作用。這些發(fā)現(xiàn)為金花茶抗腫瘤研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時為該植物資源開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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［3］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳．廣西中藥材標準［M］．第二冊．南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1996:157．

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