吳曉牧 曾玉娥 楊海玉

大腦是酒精誘導(dǎo)損傷的最常見靶器官之一，長(zhǎng)期大量飲酒可引起腦器質(zhì)性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)。酒精性癡呆（alcohol-associated dementia，AAD）是指由于長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致慢性腦器質(zhì)性損害而出現(xiàn)記憶缺損并伴有一種或一種以上認(rèn)知功能受損的精神行為異常，同時(shí)可伴有震顫、譫妄、痙攣發(fā)作等神經(jīng)功能障礙，記憶受損是其最重要和最基本的特征［1］。研究結(jié)果顯示酒精中毒已成為誘導(dǎo)癡呆發(fā)病的重要因素，AAD患者可占癡呆發(fā)病人群的21%～24%［2］。酒精可通過神經(jīng)細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑直接或間接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，致使海馬區(qū)功能性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)生不完全可逆性損害［3］。目前，酒精誘導(dǎo)海馬損傷致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的動(dòng)物模型是用于研究AAD的公認(rèn)模型。但在建立AAD動(dòng)物模型的研究中，關(guān)于酒精作用的途徑、劑量和時(shí)間尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)效果也各不相同［4－5］。本研究通過采用不同酒精干預(yù)途徑、劑量和時(shí)間建立AAD大鼠模型，并觀察大鼠行為學(xué)、海馬組織形態(tài)學(xué)變化以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，旨在探討建立AAD動(dòng)物模型的最佳方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠53只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)：HNASLKJ20102186），體質(zhì)量180～220g，按完全隨機(jī)區(qū)組法分為生理鹽水灌胃組〔n＝13，分為生理鹽水灌胃A組（n＝6）和B組（n＝7）兩個(gè)亞組〕、低劑量酒精灌胃組〔n＝18，分為低劑量酒精灌胃A組（n＝11）和B組（n＝7）〕、高劑量酒精灌胃組（n＝7）、生理鹽水腹腔注射組（n＝7）和酒精腹腔注射組（n＝8）。

1.2 方法

1.2.1 AAD模型的建立［5］：（1）低劑量酒精灌胃A組（n＝11）大鼠按體質(zhì)量4mL／kg給予20%（體積分?jǐn)?shù)）酒精灌胃，1次／d，連續(xù)28d；生理鹽水灌胃A組（n＝6）給予等量生理鹽水灌胃。（2）低劑量酒精灌胃B組（n＝7）和高劑量酒精灌胃組（n＝7）大鼠分別按體質(zhì)量4、12mL／kg給予20%（體積分?jǐn)?shù)）酒精灌胃，1次／d，連續(xù)14d；生理鹽水灌胃B組（n＝7）給予等量生理鹽水灌胃。（3）酒精腹腔注射組（n＝8）大鼠按體質(zhì)量4mL／kg腹腔注射20%（體積分?jǐn)?shù)）酒精，1次／d，連續(xù)14d；生理鹽水腹腔注射組（n＝7）給予等量生理鹽水腹腔注射。于每天給予酒精或生理鹽水之前稱體質(zhì)量。

1.2.2 AAD模型的評(píng)價(jià)：（1）一般狀況觀察：每天觀察記錄大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、睡眠、飲食、毛發(fā)和大小便情況。（2）Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）行為學(xué)檢測(cè)［6］：檢測(cè)動(dòng)物從入水至尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latency，EL），并以此作為衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)規(guī)定大鼠最長(zhǎng)游泳時(shí)間為60s，如動(dòng)物在60s內(nèi)找不到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)停留20s，記錄該次EL為60s。所有大鼠在開始給藥前均接受訓(xùn)練5d。生理鹽水灌胃A組和低劑量酒精灌胃A組大鼠分別于灌胃7、14、21、28d后進(jìn)行MWM行為學(xué)檢測(cè)；生理鹽水灌胃B組、低劑量酒精灌胃B組、高劑量酒精灌胃組、生理鹽水腹腔注射組和酒精腹腔注射組大鼠于灌胃14d后進(jìn)行MWM行為學(xué)檢測(cè)。每只動(dòng)物以3次游泳成績(jī)（分別從3個(gè)入水點(diǎn)記錄）的平均值作為該動(dòng)物的EL。

1.2.3 大鼠海馬組織蘇木素－伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色：將生理鹽水灌胃B組、低劑量酒精灌胃B組、高劑量酒精灌胃組、生理鹽水腹腔注射組和酒精腹腔注射組大鼠于14dMWM行為學(xué)檢測(cè)之后處死取腦。給予濃度為10%（體積分?jǐn)?shù)）的水合氯醛（批號(hào)：贛藥制字H20090014，江西省人民醫(yī)院藥劑科）腹腔注射麻醉大鼠，以40g／L多聚甲醛（批號(hào)：XK13-201-00153，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）灌流固定，之后取全腦以40g／L多聚甲醛固定24h，然后選取海馬部位切取厚度為2 mm的腦片，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，切取厚約4～6μm切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.2.4 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：選取大鼠海馬區(qū)進(jìn)行組織切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后用PBS洗3次，然后每張切片滴加適量Hoechst33342染色液（貨號(hào)C1025，碧云天生物技術(shù)研究所）覆蓋組織，避光染色10min，PBS洗3次后封片，采用熒光顯微鏡（型號(hào)DM3000，德國(guó)徠卡公司）20倍鏡下觀察取圖。每只大鼠各選取1張切片，在每張切片雙側(cè)海馬的海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）和CA1區(qū)分別隨機(jī)選取3個(gè)視野，并進(jìn)行凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。凋亡細(xì)胞的特征表現(xiàn)為細(xì)胞核呈明顯固縮、濃染。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較選擇LSD檢驗(yàn)（方差齊性）和Dunnett T3檢驗(yàn)（非方差齊性）；兩均數(shù)間比較則采用t檢驗(yàn)。取α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)及體質(zhì)量比較 高劑量酒精灌胃組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)能力及飲食等均較生理鹽水灌胃組和低劑量酒精灌胃組差。與生理鹽水灌胃組相比，高劑量酒精灌胃組14d后大鼠平均體質(zhì)量明顯下降〔（259.57±3.22）gvs.（279.33±5.56）g，P＝0.03〕，而低劑量酒精灌胃組大鼠的體質(zhì)量無明顯改變〔（278.10±3.94）g，P＝0.83〕。

2.2 MWM檢測(cè)結(jié)果 與生理鹽水灌胃A組相比，大鼠在給予低劑量酒精灌胃14d和28d后，其EL時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（表1）。生理鹽水組灌胃A組大鼠經(jīng)過多次MWM行為學(xué)檢測(cè)后，其EL時(shí)間呈逐漸下降趨勢(shì)，而低劑量酒精灌胃組則無明顯改變（表1）。與生理鹽水灌胃B組相比，低劑量酒精灌胃B組大鼠的EL時(shí)間明顯延長(zhǎng)〔（18.92±4.85）svs.（5.34±1.15）s，P＝0.02〕，而高劑量酒精灌胃組大鼠的 EL時(shí)間〔（9.55 ±2.30）s〕雖表現(xiàn)為延長(zhǎng)趨勢(shì)，但結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.13）。酒精腹腔注射組大鼠14d后其EL時(shí)間較生理鹽水腹腔注射組延長(zhǎng)〔（12.49±2.82）svs.（5.31±0.85）s，P＝0.04〕。

2.3 海馬HE染色觀察結(jié)果 生理鹽水灌胃B組大鼠DG和CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、完整，形態(tài)均一，細(xì)胞核未見異形、濃染等異常改變；而低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)可見大量散在分布的異常細(xì)胞，胞核固縮變形、濃染，細(xì)胞層數(shù)和密度均明顯減少（圖1）。高劑量酒精灌胃組和酒精腹腔注射組大鼠海馬DG和CA1區(qū)也可見到一些散在分布的異常細(xì)胞，而生理鹽水腹腔注射組未見異常。

2.4 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 生理鹽水灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)均一，未見異形濃染凋亡細(xì)胞；而低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)可見大量聚集分布的異形、碎片狀致密濃染凋亡細(xì)胞（圖2）。與生理鹽水灌胃B組相比，低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（73.00±9.17vs.16.00±0.89，P＜0.01）和 CA1 區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（32.67±5.06vs.9.50±2.18，P＜0.01）均明顯增加；高劑量酒精灌胃組大鼠海馬DG區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（54.33±14.52）亦較生理鹽水灌胃B組DG區(qū)增加（P＜0.05），而CA1區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（21.17±3.10）雖有一定程度增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與生理鹽水腹腔注射組相比，酒精腹腔注射組大鼠海馬 DG區(qū)（52.67±23.50vs.14.33±1.76，P＝0.18）和 CA1區(qū)（10.67±2.03vs.11.67±0.88，P＝0.67）的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量無明顯改變。

表1 各組大鼠MWM檢測(cè)EL比較 （±s，s）

表1 各組大鼠MWM檢測(cè)EL比較 （±s，s）

注：與生理鹽水灌胃A組相比，＊P＜0.05；與同組0d相比，＃P＜0.05

組別 n 0d 7d 14d 21d 28d F值 P值3.66 0.03低劑量酒精灌胃 A組 11 8.36±1.00 8.10±1.42 24.70±5.43＊ 12.59±2.78 8.15±1.07＊生理鹽水灌胃A組 6 9.44±1.30 10.42±2.06 5.68±1.30 6.82±2.55 4.52±1.14＃8.01 1.00

圖1 各組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果

圖2 酒精誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（Hoechst33342染色）

3 討論

該研究結(jié)果顯示，低劑量酒精灌胃14d后大鼠即可表現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶損害；而高劑量酒精灌胃雖然具有同樣的趨勢(shì)，但與生理鹽水灌胃組比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)高劑量酒精灌胃組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)、精神狀態(tài)、活動(dòng)能力及飲食等均差于生理鹽水灌胃組和低劑量酒精灌胃組，提示酒精劑量過高可能嚴(yán)重影響機(jī)體其他系統(tǒng)的功能，例如酒精可直接損害胃腸道黏膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響胃腸道消化吸收等生理功能等。盡管高劑量酒精灌胃對(duì)海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有一定損傷，但作者仍認(rèn)為建模時(shí)不宜采取過高的酒精劑量和濃度。另外，雖然本研究結(jié)果顯示酒精腹腔注射亦可使大鼠EL時(shí)間顯著延長(zhǎng)，但是從海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果來看，酒精腹腔注射的作用效果不明顯，提示酒精灌胃方法更適宜建立AAD模型。生理鹽水灌胃組大鼠在經(jīng)過多次游泳訓(xùn)練學(xué)習(xí)之后，其EL呈明顯縮短趨勢(shì)，提示動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力逐步增強(qiáng)；然而，低劑量酒精灌胃組大鼠并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。研究表明動(dòng)物經(jīng)過學(xué)習(xí)訓(xùn)練可引起改變腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，而這種變化是增強(qiáng)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的重要分子機(jī)制。Xu等［7］研究發(fā)現(xiàn)學(xué)習(xí)可引起動(dòng)物腦內(nèi)新的突觸結(jié)構(gòu)快速形成，并且重復(fù)訓(xùn)練可以使新形成的突觸結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，訓(xùn)練結(jié)束后也能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。Yang等［8］也研究證實(shí)小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)技能訓(xùn)練后3個(gè)月，即使30%～40%新形成的突觸結(jié)構(gòu)丟失，依然能維持先前學(xué)習(xí)的運(yùn)動(dòng)技能，且新形成的突觸存在越多，動(dòng)物的記憶力越強(qiáng)，行為表現(xiàn)也越好。以上研究結(jié)果提示酒精可能通過影響突觸可塑性而干預(yù)學(xué)習(xí)記憶形成過程，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

大量研究證實(shí)長(zhǎng)期慢性飲酒可促使海馬體積減小及海馬區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，該機(jī)制與酒精誘導(dǎo)空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)。Oliveira-da-Silva等［9］對(duì) 出 生 后 30d 至 45d 的C57BL／6小鼠給予腹腔注射酒精發(fā)現(xiàn)，酒精作用可導(dǎo)致海馬大部分區(qū)域（包括齒狀回顆粒層及分子層、CA1、CA2和CA3區(qū)）的凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，而且神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯減少。Vongvatcharanon等［10］對(duì)3月齡雌性成年Vistar大鼠給予低濃度和高濃度酒精作用3周至半年發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬區(qū)和扣帶回皮質(zhì)氨酪酸能神經(jīng)元減少和神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞增加，并且這種改變隨著飲酒時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。同樣，該研究結(jié)果也證實(shí)酒精作用可破壞大鼠海馬正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，致使海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示這些組織學(xué)改變與酒精損害學(xué)習(xí)記憶功能機(jī)制密切相關(guān)。

綜上所述，該研究建立的AAD動(dòng)物模型不僅具有行為學(xué)和海馬組織學(xué)的明顯改變，而且在一定程度上反映了AAD的發(fā)病機(jī)制和功能變化規(guī)律。

［1］李舜偉.認(rèn)知功能障礙的診斷與治療［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2006，32：189-191.

［2］Smith DM，Atkinson RM.Alcoholism and dementia［J］.Int J Addict，1995，30：1843-1869.

［3］Silvia AL，Consuelo G.Molecular and behavioral aspects of the actions of alcohol on the adult and developing brain［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2011，48：19-47.

［4］Oliveira-da-Silva A，Vieira FB，Cristina-Rodrigues F，et al.Increased apoptosis and reduced neuronal and glial densities in the hippocampus due to nicotine and ethanol exposure in adolescent mice［J］.Int J Dev Neurosci，2009，27：539-548.

［5］Alijan-pour J，Abrari K，Lashkar bluki T.Acute ethanol administration affects memory reactivation：A look at the neuronal density and apoptosis in the rat hippocampus［J］.Pharmacol Biochem Behav，2012，102：321-328.

［6］Vorhees CV ，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1：848-858.

［7］Xu TH，Yu XZ，Perlik AJ，et al.Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories［J］.Nature，2009，462：915-919.

［8］Yang G，Pan F，Gan WB.Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories［J］.Nature，2009，462：920-924.

［9］Oliveira-da-Silva A，Manh？es AC，Cristina-Rodrigues F，et al.Hippocampal increased cell death and decreased cell density elicited by nicotine and／or ethanol during adolescence are reversed during drug withdrawal［J］.Neuroscience，2010，167：163-173.

［10］Vongvatcharanon U，Mukem S，Udomuksorn W，et al.Alcohol administration during adulthood induces alterations of parvalbumin and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in rat hippocampus and cingulated cortex［J］.Acta Histochem，2009，112：392-401.