李正杰，靳茂禮，張永鋒，粘立軍，武景路，劉敏彥

(1.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035;2.石家莊市食品藥品檢驗所，河北 石家莊 050035)

連花清瘟膠囊系石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)并獲得國家專利的新藥，臨床證實其在防治SARS、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感等嚴重公共衛(wèi)生事件中顯示出了良好的效果[1－3]。采用傳統(tǒng)的乙醇回流提取工藝，提取溶劑用量大，生產(chǎn)成本高，故采用連續(xù)超聲逆流提取技術(shù)對原工藝進行了優(yōu)化和提升，并采用超高效液相色譜(UPLC)法建立超聲逆流提取液的指紋圖譜[4－5]，為連花清瘟膠囊超聲逆流提取液質(zhì)量控制標準的建立和評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Acquity UPLCHclass超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站;AT201型1/10萬分析天平(瑞士 Mettlertoledo公司);Milli－QAdvantage A10超純水系統(tǒng)(millipore)。磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20120211);乙腈(色譜純，美國Fisher公司);水為超純水，其他試劑均為分析純。連花清瘟膠囊超聲逆流提取液(批號分別為S1:120327，S2:120401，S3:120402，S4:120403，S5:120404，S6:120405，S7:1200406，S8:120407，S9:120408，S10:120409，S11:120410);連翹酯苷A(批號為111810－201102)、連翹苷(批號為110821－201112)、大黃酸(批號為110757－200206)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院;松脂素－4－O－glc對照品為自制，經(jīng)高效液相色譜分析純度大于95%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:AcquityUPLC? BEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm);檢測波長:228nm;進樣量:0.4μL;柱溫:40℃;流動相:乙腈 －0.1%磷酸溶液梯度洗脫，見表1。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

分別取連翹酯苷A、連翹苷、松脂素－4－O－glc、大黃酸對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含連翹酯苷A 0.12 g/L、連翹苷 0.13 g/L、松脂素 －4－O －glc 0.09 g/L、大黃酸 0.10 g/L 的對照品溶液。按處方量取麻黃、連翹、大黃、魚腥草，加70%乙醇，浸泡20min，超聲逆流提取，取超聲逆流提取液，用0.22μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗:取同一樣品(批號為120327)的供試品溶液在擬訂色譜條件下重復(fù)進樣6次，記錄指紋圖譜。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.1%，相對峰面積的 RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:吸取同一供試品溶液，分別于 0，2，6，12，24 h 時進樣，測定峰面積。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.2%，相對峰面積的 RSD＜1.8%。綜合分析，超聲逆流提取液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一樣品6份，依法制備供試品溶液，進行指紋圖譜分析。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.4%，相對峰面積的 RSD＜2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度分析

指紋圖譜建立:取11批超聲逆流提取液，進行UPLC指紋圖譜測定，得相應(yīng)的指紋圖譜，見圖1。并采用國家藥典委員會開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件對11批樣品的指紋圖譜進行分析，以S6為參照指紋圖譜(圖2)，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進行多點校正和自動匹配，其中共有色譜峰27個，用標準品指認了其中4個共有峰，分別為連翹酯苷A(8號峰)、連翹苷(17號峰)、松脂素－4－O－glc(10號峰)、大黃酸(24號峰)，以出峰穩(wěn)定，峰面積較大的17號色譜峰－連翹苷為參照峰。

圖1 11批連花清瘟膠囊超聲逆流提取液UPLC指紋圖譜

圖2 連花清瘟膠囊超聲逆流提取液UPLC參照指紋圖譜(S6)

指紋圖譜相似度分析:將11批超聲逆流提取液的UPLC指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會2004年版“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”軟件中，并以S6為參照指紋圖譜(圖2)，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進行了多點校正和自動匹配，生成連花清瘟膠囊超聲逆流提取液共有模式的對照指紋圖譜(R)，然后進行了相似度計算，11批超聲逆流提取液指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度見表2。

3 討論

表2 11批超聲逆流提取液指紋圖譜相似度表

對供試品溶液進行光譜檢測，比較各波長下的UPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)采用228 nm進行測定時，所得連花清瘟膠囊超聲逆流提取液所得圖譜信息量大，且峰值分布最合理，故確定波長為228 nm。

分別考察了超聲逆流30，45，60min時的樣品色譜圖，結(jié)果表明，超聲逆流45，60min樣品色譜圖中出峰相差不大，且峰面積較30min大，故超聲逆流時間確定為45min。

本試驗通過對超聲逆流提取液的研究，建立超聲逆流提取數(shù)據(jù)庫，利用UPLC快速檢測技術(shù)，實現(xiàn)了超聲逆流提取液的在線監(jiān)測，通過檢測結(jié)果，監(jiān)控超聲逆流提取過程，為保證不同批次產(chǎn)品之間的穩(wěn)定，提供了參考數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了節(jié)能生產(chǎn)、高效生產(chǎn)。

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