許雷鳴 顧 倩 武 谷

1.安徽省食品藥品檢驗所，安徽合肥 230051；2.皖南醫(yī)學院，安徽蕪湖 241000

依達拉奉是一種腦保護劑（自由基清除劑），可清除自由基，抑制脂質過氧化，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷。臨床上用于改善急性腦梗死所致的神經癥狀、日常生活活動能力和功能障礙。目前，關于依達拉奉注射液的細菌內毒素檢查限值不統(tǒng)一。國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH28302005 中細菌內毒素檢查限值為：每毫克依達拉奉中含內毒素的量應小于2.0 EU；國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH01602008 中細菌內毒素檢查限值為：每毫升中含內毒素量應小于0.5 EU；國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH10412008 中細菌內毒素檢查限值為：每毫克依達拉奉中含內毒素的量應小于3.33 EU；國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH00372011 中細菌內毒素檢查限值為：每毫克依達拉奉中含細菌內毒素的量應小于2.5 EU。查閱國外藥典，未見收載該品種。本實驗參照依達拉奉注射液現(xiàn)行標準，《中國藥典》2010年版二部“細菌內毒素檢查法”[1]以及相關細菌內毒素檢查的文獻[2-10]，考察了5個廠家的產品，研究本品對細菌內毒素檢查試驗的干擾情況，探討提高本品細菌內毒素限值的可行性，在實驗基礎上統(tǒng)一細菌內毒素檢查質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，VS-1300L-U；S648 恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠），XW-80A 混旋儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），微量取液器（50～250 μL，上海榮泰生化工程有限公司），細菌內毒素檢查用具（湛江博康海洋生物有限公司）。

1.2 試藥

依達拉奉注射液，吉林省博大制藥有限責任公司，批號：01-110904、01-110906，規(guī)格：20 mL∶30 mg。批號：02-110816、02-111108，規(guī)格：10 mL∶15 mg。吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司，批號：2012041101，規(guī)格：20 mL∶30 mg。揚州制藥有限公司，批號：20120601，規(guī)格：20 mL∶30 mg。國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，批號：1204068、1204069、1204071，規(guī)格：20 mL∶30 mg。安徽威爾曼制藥有限公司，批號：120423、120424、120515，規(guī)格：20 mL∶30 mg。

鱟試劑 （福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：12070312，靈敏度：0.06 EU/mL；規(guī)格：0.1 mL/支。 湛江安度斯生物有限公司，批號：1211081，靈敏度：0.06 EU/mL；規(guī)格：0.1 mL/支）；細菌內毒素工作標準品（凍干品）（中國食品藥品檢定研究院，效價：120 EU/支，批號：150601-201072）。細菌內毒素檢查用水（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：11102021，規(guī)格：100 mL/瓶）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解， 配制成 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ 四個濃度的內毒素標準溶液，按照細菌內毒素檢查法進行加樣操作[1-2]。每種內毒素濃度分別平行做4 管，同時用細菌內毒素檢查用水作陰性對照做 2 管。按公式 λc=antilg（ΣX/4）計算 λc值，結果見表1。由結果可知，2λ管均為陽性，0.25λ均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗有效。兩個不同廠家的2 批鱟試劑靈敏度測定值均在0.5λ～2.0λ范圍內，符合要求，可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

2.2 內毒素限值（L）的確定[2-3]

參照上述4個國家標準，采用國內現(xiàn)行標準最嚴的限度：每毫升中含內毒素量應小于0.5 EU。由于本品20 mL相當于30 mg，并且其臨床劑量以每公斤體重（mg）計，故將依達拉奉注射液細菌內毒素檢查限值定為：每毫克依達拉奉中含內毒素的量應小于0.33 EU。

2.3 干擾試驗預試驗

目前市售鱟試劑λ通常在0.50～0.03 EU/mL，根據(jù)公式MVD=C×L/λ，則依達拉奉注射液對應的最大有效稀釋倍數(shù)分別為 1、2、4、8、16 倍。取規(guī)格為 20 mL∶30 mg 的樣品，每個廠家各取一批，將5個廠家的依達拉奉注射液用細菌內毒素檢查用水分別配制成為原液、2、4、8、16倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC。同法制備上述系列溶液，向其中加入內毒素標準溶液，使每一濃度的溶液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，此系列溶液記為PPC。取福州新北生化工業(yè)有限公司和湛江安度斯生物有限公司生產的鱟試劑，分別與上述NPC 和PPC 進行反應，每一濃度重復做2管，同時設陽性對照（PC）和陰性對照（NC），干擾預試驗結果見表2。預試結果顯示，樣品在8倍以下稀釋倍數(shù)時可能對反應有抑制性干擾作用；樣品的8倍以上稀釋倍數(shù)可能對反應無干擾作用。

2.4 干擾試驗

取上述干擾預試驗的依達拉奉注射液用細菌內毒素檢查用水分別進行稀釋，使其正式干擾試驗稀釋倍數(shù)為8倍，按《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ E“細菌內毒素檢查法”凝膠法干擾試驗項進行試驗[1]，結果見表3。正式干擾試驗結果表明，采用福州新北生化工業(yè)有限公司和湛江安度斯生物有限公司生產的靈敏度均為0.06 EU/mL的鱟試劑進行試驗，Es均在0.5λ～2.0λ內且Et/Es均在0.5～2.0 之間，確認5個廠家的上述樣品稀釋8倍后對細菌內毒素檢查均無干擾，即依達拉奉注射液最大不干擾濃度為0.187 5 mg/mL。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

根據(jù)干擾試驗結果，取5個廠家12 批樣品用細菌內毒素檢查用水稀釋8倍，分別用兩個不同廠家靈敏度為0.06 EU/mL的鱟試劑，以每毫克小于0.33 EU 為細菌內毒素檢查限值，按照《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ E“細菌內毒素檢查法”凝膠限度試驗對樣品進行細菌內毒素檢查[1]，結果見表4。結果顯示，本實驗成立，供試品管呈陰性，12 批樣品均符合規(guī)定。

表2 依達拉奉注射液干擾試驗預試結果

表3 依達拉奉注射液干擾試驗結果

3 討論

為了統(tǒng)一依達拉奉注射液細菌內毒素檢查限值，提高檢驗標準，筆者參照依達拉奉注射液現(xiàn)行國家標準，擬定細菌內毒素檢查限值為0.33 EU/mg，采用2個不同廠家的鱟試劑對5個不同廠家的依達拉奉注射液進行了細菌內毒素檢查干擾試驗研究，并按該限值檢查了5個廠家生產的12 批依達拉奉注射液的細菌內毒素量。干擾實驗表明，依達拉奉注射液部分產品在較高濃度時對細菌內毒素檢查有一定的干擾，在0.187 5 mg/mL 以下濃度時對細菌內毒素檢查均無干擾。檢查結果表明，5個廠家生產的12 批樣品細菌內毒素量均小于0.33 EU/mg，符合擬定的質量標準。說明各個廠家按照目前的生產工藝和水平可以滿足擬定的限值要求，統(tǒng)一后的標準可行。統(tǒng)一后的依達拉奉注射液的細菌內毒素檢查方法如下：取本品，可用0.06 EU/mL以上的高靈敏度鱟試劑，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE），每毫克依達拉奉中含內毒素的量應小于0.33 EU。本試驗將限值統(tǒng)一為0.33 EU/mg，提高了檢驗標準，有利于更好地控制藥品質量，更好地保障用藥安全。

表4 依達拉奉注射液細菌內毒素檢查結果

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄 99-101.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310-325.

[3]肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細菌內毒素檢查方法[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（32）：159-162.

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