張向前 王雪俠

1.鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南鄭州 450052；2.河南電力醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450005；3.鄭州市婦幼保健院檢驗科，河南鄭州 450012

嚴重腎挫傷、復雜腎手術等處理過程中容易引發(fā)腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI），嚴重者可能會導致腎衰竭，因此，在進行腎手術治療的同時，保護腎組織免受損傷成為了目前臨床中的研究熱點[1]。以往多采用缺血預適應的方法防治手術引發(fā)的腎IRI。近年來，隨著減輕缺血再灌注損傷藥物的研究進展，人們逐漸傾向于應用更為簡單的藥物預適應的方法防治IRI。雙子葉植物茜草科植物巴戟天最早應用于陽痿早泄、月經不調等疾病的治療。研究表明，巴戟天醇提物能夠保護IRI 心肌組織，且能夠延緩大鼠的衰老[2-3]。本研究旨在通過觀察巴戟天醇提物對大鼠腎IRI后血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）水平、腎組織超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，腎細胞凋亡情況的變化，進而探討巴戟天醇提物對腎IRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

巴戟天醇提物提取自巴戟天（一等品，廣東省德慶縣藥材公司，河南省食品藥品檢驗所鑒定）；SOD、GSH-Px、MDA、考馬斯亮蘭蛋白測試盒（批號：20120312、20120317、20120314、20120319）均購自南京建成生物工程研究所；TUNEL 法檢測試劑盒（批號：14751125471）購自美國Roche公司；c8000 全自動生化分析儀購自美國Abbott Laboratories公司；722型分光光度計購自上海第三分析儀器廠；Biofuge Stratos 臺式高速低溫離心機（德國Heraeus公司）。

1.2 實驗動物及分組

80只健康 Wistar大鼠，雄性，6月齡，體重 220～289 g，平均（245 ±25）g，購自河南省實驗動物中心。將其隨機均分為假手術組、IRI模型組、巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組4組，每組各20只。

1.3 給藥方法

各組大鼠均正常飼養(yǎng)，巴戟天高、低劑量組大鼠均連續(xù)灌胃給予一定濃度的巴戟天醇提物 3.0 g/（kg·d）、1.5 g/（kg·d），而假手術組和IRI模型組大鼠僅給予生理鹽水灌胃，用藥7d后，建立腎IRI模型。腎IRI模型建立方法：大鼠禁食12 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 μL/g）麻醉；常規(guī)消毒和術前準備；于下腹部正中做一長約2.5cm的切口，進入腹腔，向上提起腎臟，并切除右側腎臟；用無創(chuàng)小血管夾夾閉左側腎動脈，使之缺血1 h，然后再復灌4 h，此時模型制作完畢。其中假手術組僅做腹部切口，游離雙側腎臟，分離雙側腎臟動脈。其余3組均按上述步驟制作腎IRI模型。

1.4 BUN、Cr、SOD、GSH-Px 和 MDA 水平及腎臟組織病理變化的觀察

灌流結束后，每組取10只大鼠，采集靜脈血3 mL，4℃下以3 000 r/min 離心15 min，檢測BUN 及Cr水平；然后將這10只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，取出左側腎臟，稱取100 mg 用生理鹽水制成勻漿，4℃下以3 000 r/min離心15 min，取適量上清液，檢測SOD、GSH-Px 和MDA水平，其中總蛋白檢測采用考馬斯亮蘭法。上述操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 腎細胞凋亡的檢測方法

灌流結束后，每組剩余10只大鼠取左側腎臟，用40 g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，最后制成4 μm 切片。首先進行HE 染色，觀察腎臟組織的病理變化；然后進行TUNEL 染色。TUNEL 染色后，細胞核呈藍色者為正常腎細胞；單個細胞，細胞周圍未見炎癥反應，包膜明顯皺縮，細胞核致密深染呈棕黃色。低倍鏡下選擇陽性表達明顯的區(qū)域，然后在400倍鏡下選擇5個視野計數凋亡細胞及總細胞數量，并按照公式[凋亡指數=總凋亡細胞數/總觀察細胞數×100%]計算腎臟的凋亡指數。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0 進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合兩個條件者，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎缺血再灌注損傷后HE 染色結果及血尿素氮、肌酐水平

HE 染色結果顯示：假手術組大鼠腎臟組織未見明顯的異常；IRI模型組大鼠腎臟組織腎間質輕度水腫，血管明顯擴張，炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹、變性、壞死，少數管腔內可見蛋白管型和（或）少量紅細胞；2個巴戟天組大鼠腎臟組織損傷均較IRI模型組明顯減輕，其中巴戟天高劑量組減輕更明顯。與IRI模型組相比，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組血清 BUN、Cr水平降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組血清BUN、Cr水平高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠腎缺血再灌注損傷后血清血尿素氮、肌酐水平比較（±s）

表1 大鼠腎缺血再灌注損傷后血清血尿素氮、肌酐水平比較（±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與IRI模型組比較，*P＜0.05；與巴戟天高劑量組比較，※P ＜0.05；BUN：尿素氮，Cr：肌酐

組別 只數BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）假手術組IRI模型組巴戟天高劑量組巴戟天低劑量組F值P值10 10 10 10 10.59 ±1.23 63.12±7.35△22.17±3.92*30.68±5.11*※26.987＜0.001 35.67 ±8.16 219.44 ±32.0△100.33 ±24.97*156.51.1 ±27.29*※682.782＜0.001

2.2 腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛水平

與IRI模型組比較，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組腎組織中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組SOD、GSH-Px水平低于巴戟天高劑量組，而MDA水平高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛比較（±s）

表2 大鼠腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛比較（±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與IRI模型組比較，*P＜0.05；與巴戟天高劑量組比較，※P ＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶，GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶，MDA：丙二醛

組別 只數SOD（U/mgport）GSH-Px（U/mgport）MDA（nmol/mgport）假手術組IRI模型組巴戟天高劑量組巴戟天低劑量組F值P值10 10 10 10 150.67 ±19.25 67.56 ±11.32△110.68 ±15.24*95.27 ±14.78*※96.998＜0.001 110.69±14.63 41.81 ±8.46△70.53±10.73*60.34±11.22*※233.767＜0.001 3.27 ±0.78 7.54 ±1.02△3.94 ±1.07*5.45 ±0.87*※103.125＜0.001

2.3 腎缺血再灌注損傷后凋亡指數

與IRI模型組比較，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組腎組織細胞凋亡指數降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組腎組織細胞凋亡指數高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表3。

3 討論

腎IRI是一種過程復雜、影響因素眾多的病理生理學過程，嚴重者可導致腎缺血性功能衰竭等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，另外IRI的發(fā)生也是腎移植手術失敗的主要原因之一。大量研究表明，腎IRI的形成可能與自由基過剩、細胞凋亡、細胞內鈣超載、炎癥反應等有關[4-5]。當體內自由基過剩時，就會對機體產生負性影響，造成機體生物膜的損傷，生成大量的MDA等過氧化脂質體，而MDA 不僅是過氧化反應的產物，其本身也會進一步加重機體的損傷，MDA的體內水平在一定程度上反映了機體過氧化的程度以及腎組織受損程度[6]。SOD 及GSH-Px均是體內重要的抗氧化酶，能夠清除體內過剩的自由基，兩者的體內水平一定程度上反映了機體的清除自由基的能力[2，7-8]。腎IRI 情況較重時腎組織會出現器質性病變，例如線粒體膜損傷、細胞凋亡、細胞壞死等[9-10]。研究發(fā)現，腎IRI 主要以腎小管細胞的凋亡和壞死為特征，且細胞的凋亡、壞死與早期腎組織內的自由基過剩以及機體清除自由基能力下降關系密切[11-12]。

表3 大鼠腎缺血再灌注后凋亡指數比較

本研究結果顯示：腎IRI大鼠血清BUN、Cr水平均較假手術大鼠升高，且HE 染色示大鼠腎組織有壞死變性情況的發(fā)生，而BUN水平升高提示腎小球過濾功能降低、Cr水平升高，HE 染色示的變性壞死則提示腎實性組織發(fā)生損傷，因此這提示腎IRI大鼠腎組織損傷嚴重，提示造模型成功；而應用巴戟天醇提物的大鼠BUN 及Cr水平低于腎IRI大鼠，且HE 染色結果示腎組織變性壞死程度減輕，說明巴戟天醇提物能夠保護IRI 腎組織，另外巴戟天醇提物兩個劑量組的BUN、Cr水平差異還提示其抗腎IRI 作用具有一定的劑量依賴性。本研究結果還顯示：IRI大鼠的腎組織SOD、GSH-Px水平低于假手術大鼠，而MDA水平高于假手術大鼠，進一步驗證了腎IRI 發(fā)生的自由基學說；與IRI大鼠相比，巴戟天醇提物兩個劑量組大鼠腎組織中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低，且兩個劑量組的3 種因子水平有差異，提示巴戟天醇提物的抗腎IRI 作用可能與其具有劑量依賴性的抗氧化作用有關。本研究關于腎IRI 發(fā)生后細胞凋亡的研究發(fā)現，IRI大鼠的腎組織細胞凋亡指數明顯高于假手術大鼠，提示細胞凋亡的發(fā)生是IRI 形成的病理基礎；與IRI大鼠相比，巴戟天醇提物兩個劑量組大鼠腎組織凋亡指數降低，且兩個劑量組凋亡指數有差異，提示巴戟天醇提物能夠通過其具有劑量依賴性的抗細胞凋亡作用減輕腎IRI。

綜上所述，巴戟天醇提物能夠保護腎IRI后的腎組織，這可能與其具有抗氧化和抗凋亡作用有關。

[1]劉致中，趙黎明，武飛，等.他克莫司對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及其機制的研究[J].中國病理生理雜志，2011，27（2）：386-389.

[2]汪寶軍，付潤芳，岳云霄，等.巴戟天寡糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].鄭州大學學報：醫(yī)學版，2010，45（5）：792-794.

[3]陳鑄，付潤芳，程亮新.巴戟天醇提物對D-半乳糖致衰老大鼠小腦的作用[J].中醫(yī)學報，2010，25（5）：903-907.

[4]馬駿，傅毓，劉興國，等.固本益腎膠囊對腎缺血再灌注模型大鼠的保護作用[J].中成藥，2011，33（5）：767-769.

[5]陳莉娜，王興會，余玲，等.缺血后處理對大鼠腎臟缺血/再灌注損傷的保護作用[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2011，32（6）：684-686，721.

[6]王娟，闞全程，齊躍東，等.醋柳黃酮對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].鄭州大學學報：醫(yī)學版，2011，46（4）：587-590.

[7]賈俊海，周留正，陳素仙，等.燈盞花素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護作用[J].江蘇醫(yī)藥，2011，37（5）：506-508.

[8]顧健峰，孫亞珍，李瑜芳，等.雷公藤多苷對復發(fā)性口瘡患者血漿脂質過氧化水平及超氧化水平及超氧化物岐化酶活性影響的研究[J].中國醫(yī)藥導報，2012，9（10）：95-96.

[9]Caetano AM，Vianna Filho PT，Castiglia YM，et al.Erythropoietin attenuates apoptosis after ischemia-reperfusion-induced renal injury in transiently hyperglycemic Wister rats [J].Transplant Proc，2011，43（10）：3618-3621.

[10]曹譯心，張旭，張翠薇，等.紅花提取物對腎缺血再灌注損傷的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（25）：26-28.

[11]陳斌，石洪波，張雪軍，等.Intermedin 及其受體系統在大鼠腎缺血再灌注損傷中的變化[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2011，5（14）：4061-4066.

[12]Canacankatan N，Sucu N，Aytacoglu B，et al.Affirmative effects of iloprost on apoptosis during ischemia-reperfusion injury in kidney as a distant organ[J].Ren Fail，2012，34（1）：111-118.