董 洋 郝 林 張治國 韓從輝,▲

1.東南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221009

缺血再灌注（IR）損傷是指組織或器官缺血后重獲血流灌注或氧供，組織或器官損傷反而加重的現(xiàn)象。臨床上腎IR是腎移植中不可避免的損傷之一，如何有效地預(yù)防和減輕IR損傷一直受到廣泛重視[1-2]。有研究表明，輸尿管結(jié)扎（UO）預(yù)適應(yīng)可有效減輕腎臟IR損傷，但其具體機制尚不明確[3]。熱休克蛋白27（HSP27）作為一種有效的抗細(xì)胞凋亡蛋白，能減少細(xì)胞壞死，在穩(wěn)定纖維型肌動蛋白細(xì)胞骨架中發(fā)揮重要作用[4]。本研究旨在運用野生型小鼠和腎內(nèi)靶向抑制HSP27表達的小鼠，通過建立小鼠腎臟UO及IR模型，探討HSP27在UO減輕腎IR損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

1.1.1 實驗動物 8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，體重23～28 g，無固定病原體級，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，自由進食、飲水，于清潔環(huán)境下晝夜各12 h規(guī)律飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑 包裝有干擾HSP27表達的短發(fā)夾RNA的重組腺病毒購于Invitrogen公司；抗HSP27抗體（1∶500稀釋）購于 Cell Signaling Technology公司；抗肌動蛋白（βactin）抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物購于TaKaRa公司；胱天蛋白酶3活性檢測試劑盒購于上海碧云天公司。

1.2 模型制備

1.2.1 輸尿管結(jié)扎預(yù)適應(yīng)（UO）24 h模型制備 參閱已有的UO模型基礎(chǔ)[2]，筆者進行了改進。小鼠于腹腔注射戊巴比妥鈉，短暫麻醉后，常規(guī)消毒皮膚，取下腹部正中切口，暴露左側(cè)腎臟及輸尿管，確認(rèn)輸尿管后，沿輸尿管于距腎盂1 cm用7-0絲線打一活結(jié)，結(jié)扎輸尿管，右側(cè)輸尿管不做處理，絲線的另一端待縫合切口時埋于皮下，24 h后松掉7-0絲線，使輸尿管再通。

1.2.2 腎臟缺血再灌注損傷（IR）模型制備 小鼠輸尿管再通后48 h進行IR處理。使用戊巴比妥鈉（60 mg／kg）腹腔注射麻醉小鼠，用AIT-HTP動物恒溫維持系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）維持小鼠體溫在36℃左右，腹正中線開腹，切除右腎，游離左側(cè)腎蒂，無損傷動脈夾畢左側(cè)腎蒂25 min，隨后開放血管。

1.3 檢測UO對腎IR損傷及炎性反應(yīng)的影響

為了檢測UO對腎IR損傷及炎性反應(yīng)的影響，本研究采用隨機數(shù)字表法將C57BL/6小鼠分為3組，每組各30只，進行實驗觀察：①空白對照組：以正常C57BL/6小鼠作為對照。②UO+IR組：結(jié)扎小鼠左側(cè)輸尿管24 h后再通，再通48 h后行IR處理。③non-UO+IR組：除不結(jié)扎左輸尿管，其余操作同UO+IR組。IR后24 h處死小鼠，收集血清和腎組織樣本，檢測Cr水平及TNF-α和IL-6兩種炎癥因子mRNA表達情況。

1.4 檢測UO對腎組織HSP27的影響

為了檢測UO對腎組織HSP27的影響，筆者采用隨機數(shù)字表法將C57BL/6小鼠分為2組，每組各20只，進行實驗觀察：①UO組予以左側(cè)UO處理，UO 24 h后輸尿管再通，再通48 h后處死小鼠，取左腎組織樣本，檢測HSP27蛋白表達。②non-UO組：除不結(jié)扎左輸尿管其余操作同UO組。

1.5 檢測靶向抑制小鼠腎臟HSP27表達的效果及其對UO效果的影響

采用隨機數(shù)字表法將C57BL/6小鼠分為2組，每組各50只，一組小鼠予以左腎臟實質(zhì)組織注射包裝有干擾HSP27表達的短發(fā)夾RNA的重組腺病毒100 μL靶向抑制HSP27的表達，并將該小鼠設(shè)為HSP27干擾組；另一組小鼠予以注射空病毒100 μL作為對照組。10 d后每組隨機取10只小鼠獲取左腎組織，通過蛋白質(zhì)印跡法驗證成功干擾HSP27表達后，每組再隨機分為UO+IR與non-UO+IR兩個亞組，每個亞組各20只小鼠 （UO+IR亞組及non-UO+IR亞組處理方法同方法“1.3”項下所述），再灌注24 h后取血及腎組織標(biāo)本，檢測HSP27干擾后UO對IR的影響。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 腎功能檢測 再灌注后24 h，小鼠腹腔注射少量戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動脈采血，分離血清，用Siemens公司Dade behring dimension xpand自動分析儀檢測Cr水平。1.6.2腎組織內(nèi)HSP27表達的檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法進行檢測，以 β-actin為參照，檢測腎組織內(nèi)HSP27的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.6.3 腎組織內(nèi)炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-6 mRNA水平的檢測 采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR）法，以β-actin為參照，檢測腎組織內(nèi)TNF-α及IL-6 mRNA的相對表達量。重復(fù)3次。

1.6.4 腎組織內(nèi)胱天蛋白酶3活性的檢測 各組獲取的腎組織樣本均漿后，加入細(xì)胞裂解液，然后加入胱天蛋白酶3四肽熒光底物Ac-DEVDAMC，置于37℃下反應(yīng)1 h，用熒光分光光度計分析熒光強度，激發(fā)光波長為380 nm，發(fā)射光波長為430～460 nm。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，行 t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UO減輕IR后腎損傷及炎性反應(yīng)

與空白對照組相比，UO+IR組和non-UO+IR組再灌注后24 h血清Cr水平均均明顯增高，差異均有統(tǒng)計意義（P＜0.05）； 與non-UO+IR組相比，UO+IR組Cr水平顯著下降（P＜0.05，圖1）。與Cr結(jié)果相似，UO預(yù)適應(yīng)明顯降低了IR后腎組織內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達，與non-UO+IR組相比，UO+IR組TNF-α及IL-6 mRNA的表達均明顯減少（P＜0.05，圖2）。

2.2 UO預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)腎組織內(nèi)HSP27表達上調(diào)

經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UO預(yù)適應(yīng)后小鼠腎組織內(nèi)HSP27的蛋白表達水平顯著上調(diào)，與non-UO組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.3 抑制腎組織內(nèi)HSP27表達逆轉(zhuǎn)UO的腎保護作用

HSP27干擾組小鼠在IR前無論是否進行了UO處理，其再灌注后24 h的血清Cr水平及炎癥介質(zhì) （TNF-α和IL-6）mRNA 表達均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖4、5）。

2.4 HSP27抑制細(xì)胞凋亡

對照組小鼠IR前經(jīng)UO預(yù)適應(yīng)處理能夠明顯降低再灌注后胱天蛋白酶3的表達（P＜0.05），而HSP27干擾組小鼠IR后無論是否經(jīng)UO預(yù)適應(yīng)處理胱天蛋白酶3的表達無明顯變化（P＞0.05，圖6）。

圖1 再灌注24 h后各組血清肌酐水平

圖2 再灌注24 h后各組炎癥介質(zhì)表達情況

圖3 輸尿管結(jié)扎預(yù)適應(yīng)后腎組織熱休克蛋白27表達情況

圖4 熱休克蛋白27干擾組與對照組經(jīng)輸尿管結(jié)扎及未經(jīng)輸尿管結(jié)扎后缺血再灌注24 h肌酐水平

3 討論

缺血再灌注損傷是引起急性腎功能衰竭的重要原因之一，如何防治腎臟IR損傷是臨床上迫切需要解決的問題[1-2]。腎臟IR損傷的發(fā)生機制比較復(fù)雜，目前主要可歸結(jié)為內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、氧自由基增加、線粒體損傷、一氧化氮的損耗、炎癥因子的釋放及浸潤等，均可導(dǎo)致器官功能障礙及細(xì)胞壞死、凋亡[2-5]。大量研究使用動物模型對腎臟IR損傷的預(yù)防及保護進行了廣泛研究及重點闡述，并取得了顯著進展[6]。

圖5 熱休克蛋白27干擾組與對照組經(jīng)輸尿管結(jié)扎及未經(jīng)輸尿管結(jié)扎后缺血再灌注24 h炎癥介質(zhì)表達情況

圖6 熱休克蛋白27干擾組與對照組經(jīng)輸尿管結(jié)扎及未經(jīng)輸尿管結(jié)扎后缺血再灌注24 h腎內(nèi)胱天蛋白酶3活性比較情況

熱休克蛋白（HSPs）是一組參與蛋白質(zhì)折疊、修復(fù)、變性的應(yīng)激激活蛋白[7]，其中HSP-27在抗細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[5-8]，并可通過多種途徑抑制炎性反應(yīng)[9]。Kim等[10]使用腎臟高表達HSP-27的小鼠發(fā)現(xiàn)，相比于野生型小鼠，其腎臟缺血再灌注損傷明顯減輕，并指出HSP-27可通過穩(wěn)定細(xì)胞骨架發(fā)揮減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，膽總管結(jié)扎預(yù)適應(yīng)可減輕腎IR損傷，其保護作用可能是通過HSP-27表達上調(diào)介導(dǎo)的[11]。因此，筆者有理由推測HSP-27可能參與UO減輕腎臟IR損傷的過程。

本實驗中，筆者通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)經(jīng)UO預(yù)處理后小鼠腎臟內(nèi)HSP27表達明顯上調(diào)，與筆者前期實驗結(jié)果相符[12]，表明UO介導(dǎo)的保護作用可能與HSP27有關(guān)；筆者進一步通過構(gòu)建腎臟內(nèi)靶向干擾HSP27表達的小鼠，檢測其腎臟內(nèi)HSP27被成功抑制后，予以UO和IR處理，發(fā)現(xiàn)UO減輕IR損傷的作用明顯減弱，說明HSP27在UO減輕IR后腎損傷的過程中發(fā)揮重要作用。同時，筆者還發(fā)現(xiàn)UO能明顯減輕IR后胱天蛋白酶3的表達，而這一效應(yīng)在腎內(nèi)HSP27抑制后明顯減弱，提示HSP27可能通過減少細(xì)胞凋亡的途徑參與UO介導(dǎo)的腎保護作用。盡管臨床上通過輸尿管結(jié)扎預(yù)適應(yīng)來達到減輕腎臟缺血再灌注的目的并不可行，但是對其詳細(xì)作用機制的研究能夠為未來關(guān)于腎臟缺血再灌注損傷的防治提供新的思路，對其他器官缺血再灌注損傷的研究也具有重要意義。

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