司徒綺儀 劉國棟 杜子明 黃 瑾 劉秋菊 鐘志勇

1.廣州市越秀區(qū)人民街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心藥劑科/全科，廣東廣州 510120；2.廣州市第一人民醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510180；3.廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心實驗室，廣東佛山 528248

復(fù)方甘草酸苷是以甘草中的活性物質(zhì)-甘草酸 （甘草甜素）為主要成分，輔以甘氨酸、半胱氨酸制成的胺鹽制劑，具有抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和類固醇樣作用，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性肝病、銀屑病、蕁麻疹、斑禿、過敏性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎（UC）等多種疾病的治療[1]。本實驗中觀察復(fù)方甘草酸苷對實驗性UC大鼠結(jié)腸組織病理改變，炎性損傷，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）的含量變化及結(jié)腸黏膜細(xì)胞間黏附因子-1（in-tercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）基因表達(dá)的變化，探討復(fù)方甘草酸苷對UC的治療作用及可能的機(jī)制。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

50只雄性 SD大鼠，SPF級，160～180 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證明編號：0088509、0088823。

1.2 藥物、試劑與儀器

2，4，6 -三硝基苯磺酸（TNBS）（美國 Sigma 公司，批號：021M5009）；美沙拉嗪控釋顆粒（法國愛的發(fā)制藥集團(tuán)，批號：05490）；復(fù)方甘草酸苷（秋山片劑株式會社，批號10073A）。MDA、SOD、MPO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別 為 20110716，20110720，20110721）；RT-PCR 試 劑盒（美國Invitrogen公司，批號C11744500）；PCR擴(kuò)增引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；ICAM-1試劑（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。生物組織全自動脫水機(jī)（TS-12N），生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)（BM-VII），攤片烤片機(jī)（CS-VI），生物組織全自動染色機(jī)（RS-18），均是湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica公司，RM2135），病理圖像分析系統(tǒng)（日本奧林巴斯，BX41）；艾本德核酸蛋白測定儀（Eppendorf，BioPhotometer plus）等。

2 方法

2.1 模型的建立與分組

50只SD大鼠正常喂養(yǎng)，檢疫5 d合格后，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組、復(fù)方甘草酸苷低劑量組和高劑量組，每組10只。除正常組不做任何處理外，其它組大鼠參照文獻(xiàn)[2-3]采用TNBS灌腸法復(fù)制UC大鼠模型。造模3 d后，分別給予0.9%NaCl溶液、0.9%NaCl溶液、美沙拉嗪溶液 [300 mg/（kg·d）]、 低劑量復(fù)方甘草酸苷溶液[（12.5 mg/（kg·d）]、 高劑量復(fù)方甘草酸苷溶液 [50 mg/（kg·d）]灌胃，qd，連續(xù)10 d。實驗結(jié)束前大鼠禁食12 h（不禁水），用脫頸椎法處死，迅速剖腹，取出肛門以上10 cm的結(jié)腸段，沿腸系膜縱軸剪開，用冰0.9%NaCl溶液反復(fù)沖洗干凈，凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病理學(xué)檢查與組織學(xué)形態(tài)評分

結(jié)腸組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，石蠟切片，HE染色、封片進(jìn)行病理學(xué)檢查。把制作好的切片置于光學(xué)顯微鏡下，用Olympus BX41顯微鏡在低倍視野下拍照，觀察UC病變程度并評分。參照文獻(xiàn)[4]略作修改進(jìn)行組織學(xué)損傷評分：按潰瘍有無及范圍輕、中、重分別計為 0、1、2、3 分，病變深度（達(dá)黏膜層1分，黏膜下層2分，肌層3分、漿膜4分），兩項相加得總分。

2.3 結(jié)腸黏膜組織酶含量測定

每組10只動物中隨機(jī)選取6只動物的結(jié)腸黏膜標(biāo)本，參照試劑盒說明書，用生化的方法檢測MDA、SOD、MPO酶含量的變化。

2.4 ICAM-1基因水平測定

每組10只動物中隨機(jī)選取6只動物結(jié)腸黏膜標(biāo)本，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測ICAM-1基因表達(dá)水平。取結(jié)腸黏膜約100 mg用Trizol抽提出取總RNA，測定OD值，總RNA純度和完整性檢測合格后，取5 μg總RNA按照試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的cDNA，取5.0 μL cDNA模板按 PCR試劑盒說明書加樣，以18 s rRNA作為內(nèi)參對照，PCR反應(yīng)條件如下：ICAM-1和18 s rRNA均為95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸 32 s讀板，40個循環(huán)后72℃延伸 5 min，每個標(biāo)本重復(fù)3次。1%瓊脂糖凝膠電泳 （80 V×20 min）PCR擴(kuò)增物，并用凝膠成像系統(tǒng)計算電泳條帶的光密度積分值，以模型組的基因表達(dá)為100%，用ICAM-1的相對含量反映各組基因的表達(dá)強(qiáng)弱，計算陽性對照藥美沙拉嗪和復(fù)方甘草酸苷低、高劑量對ICAM-1的抑制率。

引物序列如下：

18srRNA（112bp）上游：5'CCTGGATACCGCAGCTAGGA，下游：5'GCGGCGCAATACGAATGCCCC；ICAM-1（102bp）上游：5'CTTTAGCAGCTCAACAATGG，下游：5'CATTTTCTCCCAG GCATTC。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 組織病理改變及其評分

見圖1。

如圖1，正常組結(jié)腸結(jié)構(gòu)清楚，黏膜完整，未見增生、壞死、糜爛及潰瘍形成。模型組結(jié)腸潰瘍損傷明顯，結(jié)構(gòu)破壞，黏膜壞死脫落，腺體消失，被增生的炎性肉芽組織填充，組織學(xué)損傷評分顯著升高（P<0.05），說明造模是成功的。給藥后，復(fù)方甘草酸苷低、高劑量組潰瘍較淺表，潰瘍性結(jié)腸炎病變程度較模型組減輕，其組織學(xué)損傷評分比模型組顯著降低（P<0.05），與陽性對照一致。見表1。

表1 各組大鼠潰瘍性結(jié)腸炎組織學(xué)損傷評分

3.2 MDA、SOD、MPO 含量的變化

與正常組比較，模型組MDA含量和MPO活性升高，SOD活性降低，但均無顯著性變化（P>0.05）。與模型組相比，各治療組MDA的含量顯著降低（P<0.05），與陽性對照組相似；SOD活性有下降趨勢，但無顯著性變化 （P>0.05）；MPO 活性在陽性對照組顯著降低（P<0.05），而復(fù)方甘草酸苷低、高劑量組無顯著性變化（P>0.05）。見表2。

3.3 ICAM-1檢測

模型組ICAM-1表達(dá)水平顯著高于正常組 （P<0.05），復(fù)方甘草酸苷低劑量組ICAM-1表達(dá)水平顯著低于模型組（P<0.05），作用與陽性對照組相仿（P>0.05），但復(fù)方甘草酸苷高劑量組ICAM-1表達(dá)水平與模型組無顯著變化（P>0.05）。見表3。

4 討論

近年來，UC有逐年上升的趨勢，該病是一種慢性非特異性炎癥疾病，病程長，易復(fù)發(fā)，病因尚未明確[5]。使用TNBS建立UC大鼠模型，病程較長，各種炎癥遞質(zhì)也發(fā)生明顯變化，與人類UC相似；并且認(rèn)為該模型具有造模時間短、操作簡單、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)實用等特點，比較適合與對防治藥物的篩選和研究[6]。實驗中模型組大鼠的結(jié)腸黏膜形態(tài)及組織學(xué)損傷評分指數(shù)明顯低于正常組，表明造模成功。

表2 復(fù)方甘草酸苷對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸丙二醛、超氧化物歧化酶、髓過氧化物酶的影響（±s）

表2 復(fù)方甘草酸苷對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸丙二醛、超氧化物歧化酶、髓過氧化物酶的影響（±s）

注：與模型組比較，＃P<0.05；“1”表示每組10只動物中隨機(jī)選取6只動物結(jié)腸黏膜標(biāo)本

正常組（0.9%氯化鈉溶液）模型組（0.9%氯化鈉溶液）陽性對照組（美沙拉嗪溶液）復(fù)方甘草酸苷低劑量組復(fù)方甘草酸苷高劑量組66666 1.75±0.75 1.99±0.68 1.09±0.25＃1.18±0.48＃1.23±0.45＃組別 樣本數(shù)1（只） 丙二醛（MDA）（nmol/mgprot）97.19±13.27 85.25±24.88 70.00±12.61 65.19±24.51 78.03±19.77 0.34±0.03 0.36±0.03 0.31±0.02＃0.36±0.05 0.36±0.04超氧化物歧化（SOD）（U/mgprot）髓過氧化物酶（MPO）（單位/克濕片）

表3 復(fù)方甘草酸苷對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響（±s）

表3 復(fù)方甘草酸苷對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，＃P<0.05；“1”表示每組10只動物中隨機(jī)選取6只動物結(jié)腸黏膜標(biāo)本；“-”表示無數(shù)據(jù)

正常組（0.9%氯化鈉溶液）模型組（0.9%氯化鈉溶液）陽性對照組（美沙拉嗪溶液）復(fù)方甘草酸苷低劑量組復(fù)方甘草酸苷高劑量組66666 2.56±0.8 7.36±4.87*2.92±1.29＃2.16±0.85＃5.81±5.19--60.33±17.53 70.65±11.55 21.06±19.48組別 樣本數(shù)1（只）ICAM-1相對表達(dá)量 抑制率（%）

研究發(fā)現(xiàn)，UC的發(fā)病與氧自由基（OFR）及其觸發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)學(xué)說相關(guān)[7]：MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，臨床上多采用MDA來間接反映UC中OFR水平；SOD活性是反映機(jī)體抗炎和細(xì)胞膜功能的主要指標(biāo)；而MPO主要存在于中性粒細(xì)胞中，是中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)。ICAM-1是最早發(fā)現(xiàn)的黏附分子之一，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，白細(xì)胞，巨噬細(xì)胞表面，在炎癥過程中介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)其穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入組織，還參與多種淋巴細(xì)胞的歸巢過程[8]。疾病初期，ICAM-1的分布和表達(dá)都明顯增加，提示ICAM-1在炎癥細(xì)胞遷徙到結(jié)腸黏膜進(jìn)入病變腸組織的過程中起重要作用[9-10]。

復(fù)方甘草酸苷的主要成份甘草酸在體內(nèi)經(jīng)β-葡糖醛酸苷酶分解為甘草次酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與腎上腺皮質(zhì)激素類似，在肝內(nèi)代謝失活起到競爭性抑制作用，間接提高了體內(nèi)皮質(zhì)激素的水平。運用復(fù)方甘草酸苷治療UC正是依據(jù)其具有的抗炎和類固醇樣作用[11-12]。筆者在本實驗中對UC大鼠模型進(jìn)行研究，模型組SOD活力下降，而MDA與MPO有所升高，ICAM-1基因表達(dá)量增加，提示UC大鼠組腸黏膜清除OFR的能力下降，不能有效地抑制腸黏膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，炎癥程度加重。用藥后，結(jié)腸黏膜病變及組織學(xué)損傷評分指數(shù)顯著降低，從動物實驗驗證了復(fù)方甘草酸苷對UC的治療效果。與模型組相比，MDA的含量和ICAM-1基因的表達(dá)量在復(fù)方甘草酸苷低、高劑量組顯著地下降，提示復(fù)方甘草酸苷可以降低結(jié)腸黏膜中OFR，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與陽性對照組一致；但SOD的活性在各治療組反而降低，MPO活性沒有明顯變化，這與有關(guān)文獻(xiàn)報道不甚相符，可能是局限于實驗例數(shù)而造成統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)未見顯著性差異，需進(jìn)一步研究證實。同時，實驗中高劑量復(fù)方甘草酸苷對ICAM-1基因的表達(dá)量與模型組比未顯示有顯著性差異，一方面可能與復(fù)方甘草酸苷本身的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，另一方面也可能是ICAM-1對復(fù)方甘草酸苷的劑量敏感度不同，與ICAM-1之間并非簡單的對應(yīng)關(guān)系。復(fù)方甘草酸苷對UC的治療作用，其作用機(jī)制可能是改善組織病變程度，減輕或阻斷組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少OFR對結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制ICAM-1基因的表達(dá)有關(guān)。

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