吳偉奮 陳春美 蘇德炎 高松齡 陳慶熙 韋 浩 王春華 楊衛(wèi)忠

1.福建醫(yī)科大學(xué)體育教研部，福建福州 350108；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，福建福州 350001

運(yùn)動(dòng)療法在腦梗死、偏癱康復(fù)治療一直在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界引起廣泛關(guān)注。前期研究證實(shí)，腦梗死后出現(xiàn)的神經(jīng)功能損失與一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)有關(guān)[1-2]。研究腦缺血偏癱機(jī)制和治療的經(jīng)典動(dòng)物模型是大鼠局灶性腦缺血模型，本研究采用線栓法閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈法（middle cerebral artery occlusion，MACO）建立局灶性腦缺血大鼠模型，其目的在于探討有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)減少神經(jīng)功能缺失和腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只健康成年雄性 SD 大鼠，體重（260±10）g，清潔級(jí)，來(lái)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料飼養(yǎng)且自由飲食，室內(nèi)溫度控制在20～24℃。

1.2 局灶性腦缺血大鼠模型的建立

大鼠分籠飼養(yǎng)，待其適應(yīng)1周后，腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥鈉：35 mg/kg），參照Longa等[3]學(xué)者應(yīng)用線栓法閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈建立腦缺血大鼠模型。將其隨機(jī)分為對(duì)照組、疲勞運(yùn)動(dòng)組和有氧運(yùn)動(dòng)組，各組8只。

1.3 運(yùn)動(dòng)方式

有氧運(yùn)動(dòng)組和疲勞運(yùn)動(dòng)組均采用遞增強(qiáng)度方式進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參照Bedford等[4]的研究進(jìn)行，有氧訓(xùn)練組每周5 d，共4周，起始速度為15 m/min，時(shí)間為20 min，遞增速度3 m/min、時(shí)間5 min，運(yùn)動(dòng)至速度為20 m/min，時(shí)間為60 min后增加跑臺(tái)坡度5%；疲勞訓(xùn)練組每周6 d，共4周，遞增速度3 m/min、時(shí)間5 min，運(yùn)動(dòng)至速度為35 m/min，時(shí)間為（60±10）min后增加跑臺(tái)坡度10%；對(duì)照組正?；\內(nèi)喂養(yǎng)，不運(yùn)動(dòng)。

1.4 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)對(duì)每只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，評(píng)分參考 Longa等[3]的方法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：0分，沒(méi)有神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)（左）轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.5 腦組織標(biāo)本制作

在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)每只造模成功的大鼠進(jìn)行深度麻醉，然后用生理鹽水快速?zèng)_洗主動(dòng)脈后，剪開(kāi)大鼠頭部并暴露腦組織，快速把腦組織取出，然后包埋在冰中，在大鼠右側(cè)離額極2.5 mm處（右側(cè)額頂葉背外側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)）向后切取，稱重后，并按0.1 g每份分成數(shù)個(gè)等份，把其中的一份迅速置于電鏡固定液，剩余的-70℃冰箱保存，留著備用。

1.6 透射電鏡觀察腦缺血對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)的影響

隨機(jī)從各組腦組織標(biāo)本中各選取一份，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀進(jìn)行后固定，然后用酒精-丙酮進(jìn)行脫水，用環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑進(jìn)行包埋；切成超薄切片，用醋酸鈾、檸檬酸鉛對(duì)其進(jìn)行染色，最后應(yīng)用日立Hu-12A型（飛利浦208型）透射電鏡進(jìn)行觀察、拍照。

1.7 腦組織NO含量和NOS活性的測(cè)定

隨機(jī)從各組腦組織各選取一份標(biāo)本，標(biāo)本上的血液用4℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈，0.1 g勻漿，離心 10 min（4000 r/min），把分離得到的上清液分別用于NOS活性和NO含量的測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行操作。從武漢博士德試劑公司采購(gòu)的NO硝酸還原酶法測(cè)定試劑盒，從南京建成生物工程公司采購(gòu)的NOS活性測(cè)定試劑盒。

1.8 RT-PCR半定量分析eNOS、nNOS和iNOS基因在腦組織中的表達(dá)特點(diǎn)

從各組腦組織標(biāo)本中各隨機(jī)抽取一份，RNA用Trizol試劑抽提，并計(jì)算總RNA濃度，稱重2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再將2 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液作為模板，并在其中加入引物（β-actin，內(nèi)參照）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積 50 μL。選用的引物分別為eNOS（F5′-AGAGCATACCCGCACTTCTG-3′；R5′-GGAAGTAAGTGAGAGCCTGG-3′），nNOS （F5′-ACAAAGGAATGAATCCGTGCC-3′；R5′-GGCAGGAGGATCCAGTTAG-GA-3′），iNOS （F5′-CACGGAGAACAGCAGAGTTGG-3′；R5′-TTGTGGTGAAGGGTGTCGTG-3′），β-actin（F5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；R5′-GGATAGCACAGCCTAGATAG-3′）。 擴(kuò)增條件：先用高溫94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，接著按（eNOS：58℃；nNOS：55℃；iNOS：55℃）復(fù)性 30 s，72℃延伸1 min（上述各步驟循環(huán)35次），最后72℃繼續(xù)延伸7 min。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳和美國(guó)伯樂(lè)BIO－RAD Gel DocTMXR凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行觀察和照相，獨(dú)立重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，并用β-actin內(nèi)參照作為內(nèi)標(biāo)，然后與同步產(chǎn)物進(jìn)行比較，定量PCR產(chǎn)物，應(yīng)用Quantity-one分析軟件進(jìn)行半定量分析，該基因mRNA的水平是通過(guò)計(jì)算所得產(chǎn)物的積分光密度與各自內(nèi)參照積分光密度的比值來(lái)反映的。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組和疲勞運(yùn)動(dòng)組的神經(jīng)功能缺失評(píng)分分別為（1.64±0.25）、（0.75±0.15）分和（2.85±0.33）分，三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 透視電鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)

對(duì)照組（圖1）的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核不規(guī)則；有氧運(yùn)動(dòng)組（圖2）細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核不僅規(guī)則，而且細(xì)胞表面微絨毛豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細(xì)胞器也增多；疲勞運(yùn)動(dòng)組（圖3）細(xì)胞核分裂，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)線粒體腫脹明顯，甚至產(chǎn)生空泡狀變。

2.3 腦組織NO含量和NOS活性的測(cè)定結(jié)果

有氧運(yùn)動(dòng)組NO含量和NOS的活性均高于對(duì)照組，但低于疲勞運(yùn)動(dòng)組，三組之間差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 見(jiàn)表1。

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

注：與對(duì)照組比較，t=15.179，*P<0.01，t＝ 7.060，△P<0.01；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，t＝ 21.503，▲P<0.01，t＝ 16.667，#P<0.01

對(duì)照組有氧運(yùn)動(dòng)組疲勞運(yùn)動(dòng)組888 0.27±0.01 0.39±0.02*0.56±0.03▲0.44±0.02 0.53±0.03△0.78±0.03#組別 例數(shù) NO含量變化（μmol/g） NOS活性 （nmol/min）

2.4 RT-PCR半定量分析NOS基因結(jié)果

各小組腦組織標(biāo)本提取的總RNA λ值（OD260/OD280）在1.80～1.97之間，凝膠電泳圖顯示RNA沒(méi)有降解，RT-PCR產(chǎn)物的電泳完后，結(jié)果顯示eNOS、iNOS、nNOS和內(nèi)參照β-actin的特異性片段大小分別為625、342、501 bp和250 bp，三種NOS基因與內(nèi)參照比值在各小組之間表達(dá)不一：有氧運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；疲勞運(yùn)動(dòng)組與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），三組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明隨著運(yùn)動(dòng)量的增加，NOS基因的表達(dá)量也隨之增加。見(jiàn)表2。

表2 各組腦組織NOS基因表達(dá)變化（±s）

表2 各組腦組織NOS基因表達(dá)變化（±s）

注： 與對(duì)照組比較，t=10.119， ①P<0.01，t＝24.000， ②P<0.01，t=4.707， ③P<0.01，t＝ 12.649， ④P<0.01，t=12.522， ⑤P<0.01，t＝16.282， ⑥P<0.01； 與 有 氧 運(yùn) 動(dòng) 組 比 較 ，t ＝ 14.000，1）P<0.01，t ＝2.000，2）P<0.01，t＝13.131，3）P<0.01

對(duì)照組有氧運(yùn)動(dòng)組疲勞運(yùn)動(dòng)組888 0.19±0.01 0.43±0.02①0.29±0.02④1）0.21±0.01 0.32±0.03②0.35±0.03⑤2）0.37±0.02 0.43±0.02③0.68±0.05⑥3）組別 例數(shù) eNOS nNOS iNOS

3 討論

缺血性腦損傷是目前發(fā)病率、致殘率和病死率均較高的嚴(yán)重疾病之一，約占全部腦血管病的80%，腦缺血疾病常常出現(xiàn)肢體偏癱等并發(fā)癥，如何改善腦缺血疾病的并發(fā)癥成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)的研究熱門(mén)課題之一。同時(shí)，建立一種生理指標(biāo)控制嚴(yán)格、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠且重復(fù)性好、與人類腦缺血病理過(guò)程相似的理想腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，?duì)腦缺血病理機(jī)制和治療的研究至關(guān)重要。缺血性腦血管病中由大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）引起者占絕大多數(shù)，所以，大腦中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血模型的研究也是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。由于Longa線栓法具有創(chuàng)傷小、不開(kāi)顱、模型成功率高、偏癱癥狀接近臨床等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ头椒╗3]。本實(shí)驗(yàn)采用Longa線栓法建立的大鼠局灶性腦缺血模型后，大鼠具有以下癥狀：手術(shù)對(duì)側(cè)以前肢為主的偏癱；手術(shù)側(cè)眼球內(nèi)陷，瞳孔縮小，眼裂變?。恍g(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，靜止后尾巴呈特殊的盤(pán)繞狀及體重下降等現(xiàn)象。這些癥狀的出現(xiàn)標(biāo)志著成功建立了大鼠局灶性腦缺血模型，這是由于MCA供血區(qū)（包括頸上交感神經(jīng)通路和肌力及肌緊張的皮質(zhì)高級(jí)控制區(qū)）被阻塞，因此，大腦右側(cè)中動(dòng)脈阻塞就出現(xiàn)上述相應(yīng)癥狀。同時(shí)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是腦缺血大鼠康復(fù)治療重要的實(shí)驗(yàn)研究手段，大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式的優(yōu)點(diǎn)主要有以下幾點(diǎn)：①運(yùn)動(dòng)方式符合大鼠日常的運(yùn)動(dòng)情況；②大鼠在各自的通道內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，不會(huì)彼此干擾，使彼此之間的影響因素較少；③與游泳、運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)鼓、跳臺(tái)等運(yùn)動(dòng)方式相比，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以更加精確地調(diào)控大鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、跑臺(tái)坡度和速度等。所以，本實(shí)驗(yàn)研究選擇了跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為大鼠的運(yùn)動(dòng)方式。

NO為體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，與血管平滑肌舒張、心血管功能和神經(jīng)系統(tǒng)的病理和生理等過(guò)程密切相關(guān)[5-6]。NO在腦缺血中的病理生理作用主要包括NO的神經(jīng)保護(hù)作用和NO的神經(jīng)毒性作用。NO的神經(jīng)保護(hù)作用主要是通過(guò)增加腦血流、抗血小板和白細(xì)胞聚集黏附、增強(qiáng)突觸傳遞、阻斷N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸 （NMDA）受體、抑制內(nèi)皮素（ET）生成以及神經(jīng)元對(duì)NOS的負(fù)反饋調(diào)節(jié)等機(jī)制起到對(duì)腦神經(jīng)的保護(hù)作用。腦缺血時(shí)生成過(guò)量的興奮性氨基酸（如谷氨酸），過(guò)度刺激NMDA受體，使細(xì)胞膜對(duì)Ca2+的通透性增加，胞內(nèi)鈣離子超載，進(jìn)而引發(fā)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死；同時(shí)鈣離子超載又激活磷脂酶、蛋白酶及NOS等多種酶，使NOS神經(jīng)元產(chǎn)生過(guò)量的NO，大量的NO又激活NMDA受體，使鈣離子通道活化，細(xì)胞外鈣離子涌入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步加重神經(jīng)元損害[7]。此外，在腦缺血條件下，過(guò)量的NO還可以通過(guò)生成自由基、損傷線粒體等途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。NOS是NO合成的限速酶，是調(diào)節(jié)NO的最重要環(huán)節(jié)。NOS有3種類型[8]：內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）。NO的雙重作用在腦缺血時(shí)比較短暫，以eNOS的表達(dá)為主，由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS而合成的NO，所產(chǎn)生的NO通過(guò)擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，抑制血小板和白細(xì)胞聚集黏附，起到腦保護(hù)作用；而在腦缺血的中晚期，nNOS、iNOS起主要作用，通過(guò)介導(dǎo)谷氨酸毒性，生成氧自由基，影響細(xì)胞線粒體功能，增加炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性，nNOS表達(dá)量不高，而由梗死灶內(nèi)的吞噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)所產(chǎn)生的iNOS，可以通過(guò)NOS、Caspase-3和p38MAPK等基因的相互關(guān)系介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失[2，7，9]。

研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠改善腦缺血患者肢體偏癱癥狀，婁淑杰等[10]建立腦缺血模型，證實(shí)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)則可進(jìn)一步提高海馬的神經(jīng)再生水平，無(wú)論是缺血側(cè)還是健側(cè)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物海馬和齒狀回內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)照組動(dòng)物。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能和體重恢復(fù)，減少大鼠腦梗死體積，有利于腦缺血大鼠的康復(fù)[11-12]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與筆者的前期研究結(jié)果都是一致的，有氧訓(xùn)練增強(qiáng)大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù)[13]，在本組實(shí)驗(yàn)中，有氧運(yùn)動(dòng)組神經(jīng)功能缺失評(píng)分低于對(duì)照組，肢體活動(dòng)能力康復(fù)效果好，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠改善腦缺血后偏癱。NO和NOS表達(dá)與不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相關(guān)，田振軍等[14]等同樣采用跑臺(tái)訓(xùn)練方式，建立了大鼠有氧運(yùn)動(dòng)和疲勞運(yùn)動(dòng)模型，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)NOS的表達(dá)均有升高，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)NO的生成增加，但大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞凋亡，且與NO大量生成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組和疲勞運(yùn)動(dòng)組NO和NOS均有不同程度的升高，但從電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能缺失的評(píng)分均可以發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)組缺血神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能缺失改善明顯好于疲勞運(yùn)動(dòng)組，其機(jī)制可能是因?yàn)橛醒踹\(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的eNOS來(lái)源為主NOS表達(dá)升高，促進(jìn)NO合成增加，擴(kuò)張局部血管，改善缺血神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，促使缺血神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)[15-16]；相反，疲勞運(yùn)動(dòng)能組中大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)量引起以神經(jīng)毒性的iNOS來(lái)源為主NOS表達(dá)明顯升高，促進(jìn)NO合成大量合成，NO的過(guò)度表達(dá)出現(xiàn)局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)度均能夠促進(jìn)腦缺血區(qū)域NO和NOS的表達(dá)升高，有氧運(yùn)動(dòng)以促進(jìn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的eNOS表達(dá)為主，建立側(cè)支循環(huán)，改善腦梗死局部區(qū)域血運(yùn)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)，而疲勞運(yùn)動(dòng)使iNOS表達(dá)明顯升高，引起NO過(guò)表達(dá)，對(duì)局部神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，這對(duì)于應(yīng)用適宜運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度治療腦缺血后偏癱有十分重要的意義。

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