陳 駿 李文勝▲ 羅興菊 葉崇陽 郭蓮軍
1.湖北省宜昌市夷陵區(qū)醫(yī)療保險局,湖北宜昌 443100;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院,湖北武漢 430030
類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis)是一種慢性全身性自身免疫性疾病,病理基礎為關節(jié)滑膜炎,可導致關節(jié)功能障礙,致殘率較高。復方螞蟻酒由螞蟻、淫羊藿、烏梢蛇、木瓜等中藥組成,具有祛風除濕、舒筋活絡等功效,臨床用于治療風濕及類風濕性關節(jié)炎等。筆者前期的研究表明,復方螞蟻酒有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和增強性功能等作用[1-3]。為進一步探討其治療類風濕性關節(jié)炎的作用機制,本文觀察了復方螞蟻酒對大鼠佐劑性關節(jié)炎的防治作用及其可能的作用機制。
清潔級 SD 大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,♂,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供 (動物生產(chǎn)許可證號:醫(yī)動字第19-025號)。
復方螞蟻酒,處方由螞蟻、淫羊藿、枸杞子、烏梢蛇、木瓜、薏苡仁、大棗等中藥組成。制備方法:將淫羊藿、烏梢蛇、木瓜、薏苡仁、茯苓和丁香粉碎成粗粒,置陶制容器中,加入螞蟻、枸杞子、桑葚和大棗,加白酒(52%Vol),在不斷攪拌下密封浸泡30 d。過濾,藥渣壓榨后過濾。加入溶解后的冰糖,用蒸餾水調(diào)酒精度至38%Vol,密封靜置30 d。過濾,分裝,即得。每毫升相當于原生藥0.48 g,臨用時用白酒配制成50%濃度的稀釋液。白酒(38%Vol、52%Vol,湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。雷公藤多苷片(湖北黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn),批號091201),臨用時用注射用水配制成0.5 g/L濃度的混懸液。弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品),一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供,白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。
YLS-7A足趾容積測量儀 (山東省醫(yī)學科學院設備站產(chǎn)品),SN-682型放射免疫γ計數(shù)器 (上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn)),DL-8R冷凍離心機(上海離心機械研究所生產(chǎn)),日立7060型全自動生化分析儀。
1.4.1 動物分組及給藥 取健康SD大鼠60只,隨機分為6組,每組10只,即正常對照組、模型對照組、白酒對照組、雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組。各組大鼠均按10 mL/kg體重的劑量灌胃,每天1次,連續(xù)3 d。其中正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水,白酒對照組灌服38%Vol白酒,雷公藤多苷組灌服雷公藤多苷混懸液,復方螞蟻酒低、高劑量組分別灌服50%復方螞蟻酒稀釋液和復方螞蟻酒。
1.4.2 模型制作 于末次給藥后30 min,除正常對照組外,將其余各組大鼠在乙醚淺麻醉下,于每鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.05 mL致炎[4]。于致炎后第12天開始,各組大鼠再次按上法給藥,每天1次,連續(xù)12 d。
1.4.3 檢測指標及方法 各造模組于致炎前和致炎后第8、16、24小時及第16、20、24天用足趾容積測量儀分別測量大鼠左右后足標記線以下的容積,按文獻[5]方法計算各組的腫脹率。并觀察大鼠前肢、耳和尾部病變的發(fā)生情況和體重變化。各組動物于末次給藥后禁食24 h,在麻醉下經(jīng)腹主靜脈采血,3500 r/min離心10 min,分離血清于-70℃下保存。按試劑盒說明書操作,用硝酸還原酶法測定血清NO含量,采用放射免疫法測定血清IL-1β和TNF-α的含量。
采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件處理,計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
致炎后8 h,大鼠右后足明顯腫脹,24 h達高峰,持續(xù)4 d后逐漸減輕。其中雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠右后足腫脹率明顯低于模型對照組和白酒對照組(P<0.05 或 P<0.01)。 見表 1。
表1 各組大鼠原發(fā)性右后足腫脹率比較(±s,n=10)
表1 各組大鼠原發(fā)性右后足腫脹率比較(±s,n=10)
注:與模型對照組比較,1)P < 0.01;與白酒對照組比較,2)P < 0.05,3)P< 0.01;“-”無數(shù)據(jù)
模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組--0.005 2.400 4.800 37.65±8.58 34.52±9.69 25.89±6.121)3)27.56±7.661)2)26.78±7.251)2)組別 劑量[g/(kg·d)]53.36±10.03 51.28±11.35 35.95±9.671)3)42.69±10.321)1)40.82±9.961)3)59.67±10.79 56.38±12.26 37.41±9.841)2)46.22±10.271)3)43.96±11.031)2)致炎后不同時間右后足腫脹率(%)第8小時 第16小時 第24小時
從致炎后第10天開始,大鼠右后足再度腫脹,并因遲發(fā)型超敏反應而出現(xiàn)繼發(fā)病變,表現(xiàn)為對側左后足和前肢的腫脹,耳和尾部出現(xiàn)“關節(jié)炎”小結,食量減少,體重減輕等。其中雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠左后足腫脹率明顯低于模型對照組和白酒對照組(P<0.01),且前肢的腫脹程度、耳和尾部的結節(jié)與紅斑等損害程度、體重下降程度等均較模型對照組和白酒對照組輕。見表2。
模型對照組大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α含量明顯高于正常對照組(P<0.01),雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α含量明顯低于模型對照組和白酒對照組(P<0.05或P<0.01)。見表3。
表2 各組大鼠繼發(fā)性左后足腫脹率比較(±s,n=10)
表2 各組大鼠繼發(fā)性左后足腫脹率比較(±s,n=10)
注:與模型對照組比較:1)P < 0.01;與白酒對照組比較:2)P < 0.05,3)P< 0.01;“-”無數(shù)據(jù)
模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組--0.005 2.400 4.800 49.63±12.64 47.06±11.28 30.52±9.171)2)35.61±10.541)3)34.10±9.871)3)組別 劑量[g/(kg·d)]51.42±13.81 48.85±11.96 31.56±9.391)3)35.87±10.921)3)35.14±9.951)3)46.87±11.66 43.59±10.34 29.62±8.621)3)34.28±11.051)2)32.85±8.531)3)致炎后不同時間左后足腫脹率(%)第8天 第20天 第24天
表3 各組大鼠血清NO、IL-1β 和TNF-α 含量比較(±s,n=10)
表3 各組大鼠血清NO、IL-1β 和TNF-α 含量比較(±s,n=10)
注:與模型對照組比較:1)P < 0.01;與白酒對照組比較:2)P < 0.05,3)P <0.01;“-”無數(shù)據(jù);NO:一氧化氮;IL-1β:白細胞介素-1β;TNF-α:腫瘤壞死因子-α
正常對照組模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組---0.005 2.400 4.800 36.92±8.271)3)68.36±13.45 63.84±12.09 46.41±11.861)3)52.73±12.181)2)50.87±10.691)3)組別 劑量[g/(kg·d)]NO(μmol/L)69.33±13.561)3)146.85±31.40 138.76±29.53 92.17±25.861)3)107.40±28.041)3)101.29±23.651)3)20.64±7.211)3)57.96±16.47 54.89±15.23 35.70±13.631)3)41.14±12.281)2)40.55±13.091)2)IL-1β(μg/L) TNF-α(μg/L)
大鼠佐劑性關節(jié)炎是一種以關節(jié)滑膜組織破壞為特征的免疫性關節(jié)炎模型,其病理表現(xiàn)特征和發(fā)病機制與人類風濕性關節(jié)炎相接近[6]。現(xiàn)代研究認為,類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病原因主要是細胞免疫異常所引起,細胞因子、TH1/TH2細胞平衡和性激素等在其的發(fā)病中起重要作用,其中IL-1β和TNF-α在其進展中起著決定性作用[7]。IL-1β主要由巨噬細胞分泌,內(nèi)皮細胞和淋巴細胞也能產(chǎn)生,能誘導一系列全身的炎性反應,包括引起發(fā)熱和消瘦,合成急性期蛋白,也可對軟骨和骨基質(zhì)代謝產(chǎn)生局部作用[8]。TNF-α是機體炎性反應與免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子,能刺激滑膜細胞和軟骨細胞合成PGE2和膠原酶,導致關節(jié)局部滑膜炎癥和軟骨組織破壞。TNF-α主要導致類風濕性關節(jié)炎初期的關節(jié)腫脹,而軟骨的侵蝕則由IL-1β介導且和免疫復合物有協(xié)同效應[9-10]。NO與類風濕性關節(jié)炎關節(jié)組織炎癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關。NO可促進巨噬細胞合成釋放IL-1β、TNF-α等細胞因子,導致滑膜及炎癥細胞產(chǎn)生和釋放的前列腺素增多,加重炎性反應[11]。而IL-1β、TNF-α等細胞因子又可以刺激誘導類風濕性關節(jié)炎滑膜組織的巨噬細胞和滑膜細胞中的iNOS表達上調(diào),從而持續(xù)合成大量的NO,導致惡性循環(huán)[12]。本實驗結果提示,佐劑性關節(jié)炎模型大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α水平顯著升高。并不同程度地出現(xiàn)繼發(fā)病變,表現(xiàn)為對側左后足和前肢的腫脹、耳和尾部結節(jié)、食量減少、體重減輕等。經(jīng)雷公藤多苷和復方螞蟻酒治療后,大鼠佐劑性關節(jié)炎繼發(fā)病變顯著減輕,血清NO、IL-1β和TNF-α水平明顯降低。提示復方螞蟻酒治療大鼠佐劑性關節(jié)炎的機制可能與其降低炎癥介質(zhì)NO含量和抑制IL-1β、TNF-α等細胞因子活性有關。
[1]何行玲,李文勝,方躍華,等.復方螞蟻酒的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(7):1656-1657.
[2]方躍華,屈萬紅,黃祖明,等.復方螞蟻酒對小鼠免疫功能的影響[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(28):3-4.
[3]黃品信,李艷,程昌明,等.復方螞蟻酒對小鼠附性器官及血清睪酮和一氧化氮的影響[J].醫(yī)藥導報,2012,31(10):1288-1290.
[4]陳柏松,徐玉東,鐘淑琦,等.大鼠佐劑性關節(jié)炎模型的建立與評價[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2005,39(6):489-491.
[5]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:715-719.
[6]Jacobson PB,Borgan SJ,Wilcox DM,et al.A new spin on an old model:in vivo eveluation of disease progress by magnetic resonance imaging with respect to standard inflammatory parameters and histopthology in adjuvant arthritic rat[J].Arthritis Rheum,1999,42(10):2060-2065.
[7]Cvetkovic JT,Wallberg-Jonsson S,Stegmayr B,et al.Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of the TNF-α,IL-1β and IL-1Ra genes[J].J Rheumatol,2002,29(2):212-219.
[8]GoldringSR.Pathogenesisofboneandcartilagedestructioninrheumatoid arthritis[J].Rheumatology(Oxford),2003,42(Suppl 2):11-16.
[9]Dinarello CA.Interleukin-1 and tumour necrosis factor:effectocytokines in autoimmun diseases[J].Semin Immunol,1992,4(3):133-145.
[10]Wim B,van den Berg WB.Anti-cytokine therapy in chronic destructive arthritis[J].Arthritis Res,2001,3(1):18-26.
[11]王宇,陳鋼,駱世忠,等.四神煎加味對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清白介素-6及一氧化氮的影響[J].成都中醫(yī)藥大學學報,2004,27(1):30-31.
[12]Pelletier JP,Mineau F,Ranger P,et al.The increased synthesis of inducible nitric oxide inhibits IL-1Ra synthesis by human articular chondrocytes:possible role in osteoarthritic cartilage degradation[J].Osteoarthritis Cartilage,1996,4(1):77-84.