陳 駿 李文勝▲ 羅興菊 葉崇陽 郭蓮軍

1.湖北省宜昌市夷陵區(qū)醫(yī)療保險局，湖北宜昌 443100；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院，湖北武漢 430030

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎為關節(jié)滑膜炎，可導致關節(jié)功能障礙，致殘率較高。復方螞蟻酒由螞蟻、淫羊藿、烏梢蛇、木瓜等中藥組成，具有祛風除濕、舒筋活絡等功效，臨床用于治療風濕及類風濕性關節(jié)炎等。筆者前期的研究表明，復方螞蟻酒有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和增強性功能等作用[1-3]。為進一步探討其治療類風濕性關節(jié)炎的作用機制，本文觀察了復方螞蟻酒對大鼠佐劑性關節(jié)炎的防治作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級 SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，♂，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供 （動物生產(chǎn)許可證號：醫(yī)動字第19-025號）。

1.2 試藥

復方螞蟻酒，處方由螞蟻、淫羊藿、枸杞子、烏梢蛇、木瓜、薏苡仁、大棗等中藥組成。制備方法：將淫羊藿、烏梢蛇、木瓜、薏苡仁、茯苓和丁香粉碎成粗粒，置陶制容器中，加入螞蟻、枸杞子、桑葚和大棗，加白酒（52%Vol），在不斷攪拌下密封浸泡30 d。過濾，藥渣壓榨后過濾。加入溶解后的冰糖，用蒸餾水調(diào)酒精度至38%Vol，密封靜置30 d。過濾，分裝，即得。每毫升相當于原生藥0.48 g，臨用時用白酒配制成50%濃度的稀釋液。白酒（38%Vol、52%Vol，湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）。雷公藤多苷片（湖北黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)，批號091201），臨用時用注射用水配制成0.5 g/L濃度的混懸液。弗氏完全佐劑（Sigma公司產(chǎn)品），一氧化氮（NO）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。

1.3 儀器

YLS-7A足趾容積測量儀 （山東省醫(yī)學科學院設備站產(chǎn)品），SN-682型放射免疫γ計數(shù)器 （上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn)），DL-8R冷凍離心機（上海離心機械研究所生產(chǎn)），日立7060型全自動生化分析儀。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 取健康SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只，即正常對照組、模型對照組、白酒對照組、雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組。各組大鼠均按10 mL/kg體重的劑量灌胃，每天1次，連續(xù)3 d。其中正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，白酒對照組灌服38%Vol白酒，雷公藤多苷組灌服雷公藤多苷混懸液，復方螞蟻酒低、高劑量組分別灌服50%復方螞蟻酒稀釋液和復方螞蟻酒。

1.4.2 模型制作 于末次給藥后30 min，除正常對照組外，將其余各組大鼠在乙醚淺麻醉下，于每鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.05 mL致炎[4]。于致炎后第12天開始，各組大鼠再次按上法給藥，每天1次，連續(xù)12 d。

1.4.3 檢測指標及方法 各造模組于致炎前和致炎后第8、16、24小時及第16、20、24天用足趾容積測量儀分別測量大鼠左右后足標記線以下的容積，按文獻[5]方法計算各組的腫脹率。并觀察大鼠前肢、耳和尾部病變的發(fā)生情況和體重變化。各組動物于末次給藥后禁食24 h，在麻醉下經(jīng)腹主靜脈采血，3500 r/min離心10 min，分離血清于-70℃下保存。按試劑盒說明書操作，用硝酸還原酶法測定血清NO含量，采用放射免疫法測定血清IL-1β和TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對佐劑性關節(jié)炎大鼠原發(fā)性關節(jié)炎的影響

致炎后8 h，大鼠右后足明顯腫脹，24 h達高峰，持續(xù)4 d后逐漸減輕。其中雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠右后足腫脹率明顯低于模型對照組和白酒對照組（P<0.05 或 P<0.01）。 見表 1。

表1 各組大鼠原發(fā)性右后足腫脹率比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠原發(fā)性右后足腫脹率比較（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，1）P ＜ 0.01；與白酒對照組比較，2）P ＜ 0.05，3）P＜ 0.01；“-”無數(shù)據(jù)

模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組--0.005 2.400 4.800 37.65±8.58 34.52±9.69 25.89±6.121）3）27.56±7.661）2）26.78±7.251）2）組別 劑量[g/（kg·d）]53.36±10.03 51.28±11.35 35.95±9.671）3）42.69±10.321）1）40.82±9.961）3）59.67±10.79 56.38±12.26 37.41±9.841）2）46.22±10.271）3）43.96±11.031）2）致炎后不同時間右后足腫脹率（%）第8小時 第16小時 第24小時

2.2 對佐劑性關節(jié)炎大鼠繼發(fā)性關節(jié)炎的影響

從致炎后第10天開始，大鼠右后足再度腫脹，并因遲發(fā)型超敏反應而出現(xiàn)繼發(fā)病變，表現(xiàn)為對側左后足和前肢的腫脹，耳和尾部出現(xiàn)“關節(jié)炎”小結，食量減少，體重減輕等。其中雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠左后足腫脹率明顯低于模型對照組和白酒對照組（P<0.01），且前肢的腫脹程度、耳和尾部的結節(jié)與紅斑等損害程度、體重下降程度等均較模型對照組和白酒對照組輕。見表2。

2.3 對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α含量的影響

模型對照組大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α含量明顯高于正常對照組（P<0.01），雷公藤多苷組和復方螞蟻酒低、高劑量組大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α含量明顯低于模型對照組和白酒對照組（P<0.05或P<0.01）。見表3。

表2 各組大鼠繼發(fā)性左后足腫脹率比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠繼發(fā)性左后足腫脹率比較（±s，n=10）

注：與模型對照組比較：1）P ＜ 0.01；與白酒對照組比較：2）P ＜ 0.05，3）P＜ 0.01；“-”無數(shù)據(jù)

模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組--0.005 2.400 4.800 49.63±12.64 47.06±11.28 30.52±9.171）2）35.61±10.541）3）34.10±9.871）3）組別 劑量[g/（kg·d）]51.42±13.81 48.85±11.96 31.56±9.391）3）35.87±10.921）3）35.14±9.951）3）46.87±11.66 43.59±10.34 29.62±8.621）3）34.28±11.051）2）32.85±8.531）3）致炎后不同時間左后足腫脹率（%）第8天 第20天 第24天

表3 各組大鼠血清NO、IL-1β 和TNF-α 含量比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清NO、IL-1β 和TNF-α 含量比較（±s，n=10）

注：與模型對照組比較：1）P ＜ 0.01；與白酒對照組比較：2）P ＜ 0.05，3）P ＜0.01；“-”無數(shù)據(jù)；NO：一氧化氮；IL-1β：白細胞介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

正常對照組模型對照組白酒對照組雷公藤多苷組復方螞蟻酒組---0.005 2.400 4.800 36.92±8.271）3）68.36±13.45 63.84±12.09 46.41±11.861）3）52.73±12.181）2）50.87±10.691）3）組別 劑量[g/（kg·d）]NO（μmol/L）69.33±13.561）3）146.85±31.40 138.76±29.53 92.17±25.861）3）107.40±28.041）3）101.29±23.651）3）20.64±7.211）3）57.96±16.47 54.89±15.23 35.70±13.631）3）41.14±12.281）2）40.55±13.091）2）IL-1β（μg/L） TNF-α（μg/L）

3 討論

大鼠佐劑性關節(jié)炎是一種以關節(jié)滑膜組織破壞為特征的免疫性關節(jié)炎模型，其病理表現(xiàn)特征和發(fā)病機制與人類風濕性關節(jié)炎相接近[6]。現(xiàn)代研究認為，類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病原因主要是細胞免疫異常所引起，細胞因子、TH1/TH2細胞平衡和性激素等在其的發(fā)病中起重要作用，其中IL-1β和TNF-α在其進展中起著決定性作用[7]。IL-1β主要由巨噬細胞分泌，內(nèi)皮細胞和淋巴細胞也能產(chǎn)生，能誘導一系列全身的炎性反應，包括引起發(fā)熱和消瘦，合成急性期蛋白，也可對軟骨和骨基質(zhì)代謝產(chǎn)生局部作用[8]。TNF-α是機體炎性反應與免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子，能刺激滑膜細胞和軟骨細胞合成PGE2和膠原酶，導致關節(jié)局部滑膜炎癥和軟骨組織破壞。TNF-α主要導致類風濕性關節(jié)炎初期的關節(jié)腫脹，而軟骨的侵蝕則由IL-1β介導且和免疫復合物有協(xié)同效應[9-10]。NO與類風濕性關節(jié)炎關節(jié)組織炎癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關。NO可促進巨噬細胞合成釋放IL-1β、TNF-α等細胞因子，導致滑膜及炎癥細胞產(chǎn)生和釋放的前列腺素增多，加重炎性反應[11]。而IL-1β、TNF-α等細胞因子又可以刺激誘導類風濕性關節(jié)炎滑膜組織的巨噬細胞和滑膜細胞中的iNOS表達上調(diào)，從而持續(xù)合成大量的NO，導致惡性循環(huán)[12]。本實驗結果提示，佐劑性關節(jié)炎模型大鼠血清NO、IL-1β和TNF-α水平顯著升高。并不同程度地出現(xiàn)繼發(fā)病變，表現(xiàn)為對側左后足和前肢的腫脹、耳和尾部結節(jié)、食量減少、體重減輕等。經(jīng)雷公藤多苷和復方螞蟻酒治療后，大鼠佐劑性關節(jié)炎繼發(fā)病變顯著減輕，血清NO、IL-1β和TNF-α水平明顯降低。提示復方螞蟻酒治療大鼠佐劑性關節(jié)炎的機制可能與其降低炎癥介質(zhì)NO含量和抑制IL-1β、TNF-α等細胞因子活性有關。

[1]何行玲，李文勝，方躍華，等.復方螞蟻酒的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（7）：1656-1657.

[2]方躍華，屈萬紅，黃祖明，等.復方螞蟻酒對小鼠免疫功能的影響[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4（28）：3-4.

[3]黃品信，李艷，程昌明，等.復方螞蟻酒對小鼠附性器官及血清睪酮和一氧化氮的影響[J].醫(yī)藥導報，2012，31（10）：1288-1290.

[4]陳柏松，徐玉東，鐘淑琦，等.大鼠佐劑性關節(jié)炎模型的建立與評價[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2005，39（6）：489-491.

[5]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：715-719.

[6]Jacobson PB，Borgan SJ，Wilcox DM，et al.A new spin on an old model：in vivo eveluation of disease progress by magnetic resonance imaging with respect to standard inflammatory parameters and histopthology in adjuvant arthritic rat[J].Arthritis Rheum，1999，42（10）：2060-2065.

[7]Cvetkovic JT，Wallberg-Jonsson S，Stegmayr B，et al.Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of the TNF-α，IL-1β and IL-1Ra genes[J].J Rheumatol，2002，29（2）：212-219.

[8]GoldringSR.Pathogenesisofboneandcartilagedestructioninrheumatoid arthritis[J].Rheumatology（Oxford），2003，42（Suppl 2）：11-16.

[9]Dinarello CA.Interleukin-1 and tumour necrosis factor：effectocytokines in autoimmun diseases[J].Semin Immunol，1992，4（3）：133-145.

[10]Wim B，van den Berg WB.Anti-cytokine therapy in chronic destructive arthritis[J].Arthritis Res，2001，3（1）：18-26.

[11]王宇，陳鋼，駱世忠，等.四神煎加味對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清白介素-6及一氧化氮的影響[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2004，27（1）：30-31.

[12]Pelletier JP，Mineau F，Ranger P，et al.The increased synthesis of inducible nitric oxide inhibits IL-1Ra synthesis by human articular chondrocytes：possible role in osteoarthritic cartilage degradation[J].Osteoarthritis Cartilage，1996，4（1）：77-84.