亓英國

山東省萊蕪市人民醫(yī)院市中分院骨三科，山東萊蕪 271100

褪黑素（melatonin，MT）是一種由松果體分泌的具有多種生物效應(yīng)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，以往多種研究表明其對脊髓損傷具有清除氧自由基、抗炎、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等脊神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]，而對其促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)及對神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）水平影響的相關(guān)研究較少。NGF是首個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，由神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，對神經(jīng)細(xì)胞具有強(qiáng)大的修復(fù)、保護(hù)作用[4]。本研究通過觀察MT對脊髓損傷大鼠血清及脊髓內(nèi)NGF表達(dá)水平的影響，探討MT對損傷脊髓保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

84只 8～10 周健康成年雄性 SD 大鼠，體重（250±30）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK（粵）2011-0004]。

1.2 試劑與儀器

MT、蘇木精、伊紅均購自美國Sigma公司，無水乙醇、10%水合氯醛、大鼠NGF檢測酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒、兔抗鼠NGF多克隆抗體、Trizol試劑、DAB試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，PCR試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。美國ABI PCR 9700型PCR擴(kuò)增儀，美國STAT FAX2100全自動酶標(biāo)儀，北京君意JY025型凝膠紫外分析儀，HPIAS-1000彩色病理圖像報(bào)告分析系統(tǒng)。

1.3 脊髓損傷動物模型建立

依據(jù)改良Allen法制作脊髓損傷大鼠模型[5]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，T11～13為術(shù)區(qū)，備皮消毒后做正中縱向切口暴露目標(biāo)棘突和椎板，咬除椎板暴露脊髓硬膜，范圍約0.6 cm×0.3 cm。采用質(zhì)量為10 g的條形金屬重錘于距硬膜2.5 cm處做自由落體運(yùn)動打擊暴露處脊髓形成脊髓急性損傷。以大鼠尾部及下肢出現(xiàn)抽搐、硬膜充血水腫為模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)。清洗、消毒后縫合術(shù)口。

1.4 分組及實(shí)驗(yàn)方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型對照組（36只）、模型MT組（36只）及假手術(shù)組（12只），模型對照組和模型MT組隨機(jī)分為A、B、C亞組，各12只。模型對照組和模型MT組依“1.3”法制作模型，判斷模型成功后，模型對照組各亞組給予100 mg/kg無水乙醇1次，腹腔內(nèi)注射；模型MT組各亞組給予100 mg/kg MT注射液腹腔內(nèi)注射1次。假手術(shù)組則僅依“1.3”法暴露硬膜，并不損傷脊髓。三組術(shù)后進(jìn)行神經(jīng)功能評價，繼續(xù)人工飼養(yǎng)，均給予抗感染（青霉素20萬U/d肌注）治療，生存期＞3 d則給藥3 d，人工輔助排尿排便（4次/d）。術(shù)后12 h模型對照組及模型MT組的A組再次進(jìn)行神經(jīng)功能評價后斷頭處死取材，模型對照組及模型MT組的B、C組分別于術(shù)后3、5 d進(jìn)行神經(jīng)功能評價后斷頭處死取材。

1.5 觀察指標(biāo)檢測

1.5.1 血清NGF檢測 大鼠斷頭取血2 mL室溫靜置30 min，3000 r/min離心15 min取血清儲存于-20℃冰箱備用。采用大鼠NGF檢測酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測血清NGF水平，操作方法按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.2 脊髓組織NGF免疫組化檢測 解剖患處，取以T12為中心的約1 cm脊髓生理鹽水沖洗，均分為2段。上段進(jìn)行常規(guī)制片蘇木精-伊紅染色，厚度5 μm，各組按1∶5比例取5張切片，采用兔抗鼠NGF多克隆抗體按試劑盒說明進(jìn)行染色標(biāo)記，DAB顯色，于顯微鏡下觀察。HPIAS-1000彩色病理圖像報(bào)告分析系統(tǒng)對每張片隨機(jī)5個400倍視野陽性神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均呈棕色或棕褐色為陽性。

1.5.3 脊髓組織NGF mRNA檢測 采用PCR擴(kuò)增法。脊髓標(biāo)本下段于-80℃凍存，取凍存樣品研碎后采用Trizol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分析圖像對比NGF與GAPDH灰度值，以其比值作為NGF mRNA相對表達(dá)量。

1.5.4 神經(jīng)功能評價 采用Tarlov評分法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評價，0～5分為完全癱瘓至正常。脊髓損傷模型完成后Tarlov評分為1～4分方能繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 脊髓組織NGF mRNA PCR擴(kuò)增引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷大鼠模型及神經(jīng)功能情況

模型對照組和模型MT組72只大鼠脊髓損傷模型均建立成功，術(shù)后12 h兩組Tarlov評分顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05），模型MT組Tarlov評分稍高于模型對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后 3、5 d模型MT組Tarlov評分均顯著高于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.2 脊髓損傷大鼠血清NGF水平

術(shù)后12 h、3、5 d模型對照組和模型MT組血清NGF水平均顯著上升，模型MT組NGF水平高于模型對照組（P＜0.05或 P＜0.01），見表 2。

2.3 脊髓損傷大鼠脊髓組織NGF蛋白表達(dá)情況

脊髓切片中NGF陽性神經(jīng)細(xì)胞染色呈棕褐色，集中于脊髓前角及周圍灰質(zhì)。術(shù)后12 h模型對照組和模型MT組NGF蛋白在脊髓組織中的表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組。見圖1。模型對照組、模型MT組術(shù)后12 h、3、5 d NGF蛋白在脊髓組織中的表達(dá)呈上升趨勢，而模型MT組上升更為顯著且高于模型對照組（P＜0.05）。見表2。

2.4 脊髓損傷大鼠脊髓組織NGF mRNA表達(dá)情況

術(shù)后模型對照組和模型MT組脊髓組織NGF mRNA表達(dá)升高，顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；模型MT組脊髓組織NGF mRNA表達(dá)均顯著高于模型對照組（P＜0.05或P ＜ 0.01）。 見表 2、圖 2。

表2 三組各時間點(diǎn)Tarlov評分、血清NGF水平、脊髓組織NGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及 mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表2 三組各時間點(diǎn)Tarlov評分、血清NGF水平、脊髓組織NGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及 mRNA表達(dá)情況比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05，△P＜0.01，“-”代表無數(shù)據(jù)；NGF：神經(jīng)生長因子

假手術(shù)組Tarlov評分（分）血清 NGF（ng/L）NGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（個/HP）NGF mRNA模型對照組Tarlov評分（分）血清 NGF（ng/L）NGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（個/HP）NGF mRNA模型MT組Tarlov評分（分）血清 NGF（ng/L）NGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（個/HP）NGF mRNA 5.00±0.00 31.63±2.18 4.29±0.48 0.097±0.012 2.48±0.27*37.82±3.49*7.34±0.56*0.374±0.05*2.61±0.32*48.35±4.13*#9.28±0.67*#0.431±0.095*#----2.53±0.23 39.24±4.21 8.28±0.63 0.439±0.073 2.95±0.42#56.32±5.32#13.26±0.89#0.763±0.102#----2.52±0.32 42.85±3.82 8.35±0.87 0.462±0.071 3.11±0.45△61.85±6.83△14.93±0.95△0.893±0.121△組別 術(shù)后12 h 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d

3 討論

MT在神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛且具有多種生物效應(yīng)，已經(jīng)被證實(shí)在減輕對脊髓神經(jīng)細(xì)胞的破壞、減少凋亡等方面對脊髓損傷患者神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，作為一種功能復(fù)雜的內(nèi)源性激素，MT對神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化同樣具有調(diào)控作用[6]。NGF通過刺激凋亡抑制因子bal-2表達(dá)升高，抑制凋亡促進(jìn)因子bax蛋白表達(dá)，促使bal-2與bax比值偏移，從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。高表達(dá)的NGF對損傷軸突有促進(jìn)生長和加速再生的作用，并且在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化、生長、再生和功能恢復(fù)均有重要調(diào)控作用[7-8]。內(nèi)源性NGF在脊髓損傷后表達(dá)會保護(hù)性升高，但由于無法維持有效濃度從而達(dá)不到促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的作用。

本研究采用大鼠建立脊髓損傷模型，由于NGF基因?qū)偌丛缁?，因而在術(shù)后立即給藥，術(shù)后12 h NGF早期表達(dá)并開始對神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響，術(shù)后內(nèi)源性NGF呈現(xiàn)上升趨勢，到第5天達(dá)到峰值，因此，本研究選擇了術(shù)后12 h、3及5 d作為觀察時點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，MT有促脊髓損傷大鼠體內(nèi)血清及脊髓組織中NGF水平升高作用。通過對三組大鼠術(shù)后12 h神經(jīng)系統(tǒng)功能評價發(fā)現(xiàn)，兩個模型組大鼠Tarlov評分均顯著低于假手術(shù)組，而模型MT組評分稍高于模型對照組，但差異不顯著?？赡苡捎诩顾枞蕴幱谛菘藸顟B(tài)，癥狀緩解表現(xiàn)尚不明顯。而此時兩模型組血清NGF水平、脊髓組織切片NGF蛋白及NGF mRNA表達(dá)水平已較假手術(shù)組顯著上升，模型MT組上升幅度明顯高于模型對照組，此后兩模型組大鼠體內(nèi)NGF表達(dá)均有上升趨勢，模型MT組血清和脊髓中NGF表達(dá)出現(xiàn)大幅度升高，而模型對照組上升趨勢則較為平緩。不僅如此，兩組神經(jīng)功能恢復(fù)狀態(tài)也呈現(xiàn)顯著差異，術(shù)后3、5 d模型MT組Tarlov評分有顯著回升，下肢運(yùn)動功能逐漸恢復(fù)，且據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠精神狀態(tài)較好，飲食恢復(fù)較快，而模型對照組則進(jìn)展不明顯。表明脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，而內(nèi)源性NGF生理性出現(xiàn)升高，起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，但效果并不佳，而通過給予MT促進(jìn)內(nèi)源性NGF的表達(dá)，大鼠體內(nèi)NGF水平明顯升高，并可到達(dá)有效濃度，對神經(jīng)系統(tǒng)再生和功能修復(fù)產(chǎn)生作用。NGF直接給藥會受到利用率低、半衰期短等限制[9]，而MT具有高度脂溶性和水溶性，可輕易透過血腦屏障和細(xì)胞膜進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用[10]，促進(jìn)內(nèi)源性NGF表達(dá)，自身也具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，治療脊髓損傷具有明顯優(yōu)勢。

綜上所述，MT對脊髓損傷后神經(jīng)系統(tǒng)不僅具有減少損傷的保護(hù)作用，還通過促進(jìn)體內(nèi)NGF的表達(dá)促使神經(jīng)細(xì)胞及軸突的再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化，改善神經(jīng)功能，增強(qiáng)對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)。

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