伍韻賢 曾昭華 蘇子焯 劉寶驊 杜一鵬 梁麗英

1.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510375；2.廣東省廣州市海珠區(qū)石溪中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，廣東廣州 510375

MicroRNA-29（miR-29）是新近發(fā)現(xiàn)的一類小分子RNA家族，能識(shí)別特定的mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。MiR-29可通過直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和調(diào)控多種與纖維化相關(guān)的信號(hào)通路參與纖維化的過程[2]。miR-29 包括 miR-29a，miR-29b 和 miR-29c，本實(shí)驗(yàn)通過觀察Apo-E（-/-）小鼠主動(dòng)脈根部血管miR-29b表達(dá)情況，了解miR-29b與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立

實(shí)驗(yàn)組（FS 組）：8 只，雄性，體重在 18～22 g，5 周齡，SPF級(jí)載脂蛋白E基因敲除（C57BL/6J-ApoE）小鼠。對(duì)照組（NS組）：8只，雄性，相同體重范圍及相同周齡的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠。實(shí)驗(yàn)用小鼠均購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物中心，在廣州呼吸疾病研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。高脂喂食15周（1%膽固醇+15%豬油），飲用水為蒸餾水，飲水及飼料不限。飼養(yǎng)室溫保持在18～20℃，環(huán)境相對(duì)濕度40%～70%。小鼠20周齡取材。

測(cè)體重，取血測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC），預(yù)測(cè)模型組TC水平比正常對(duì)照組高6～10倍時(shí)，模型建立可能成功。遂取血管標(biāo)本觀察有無動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，以確定模型建立是否成功。如無明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，則繼續(xù)高脂飼養(yǎng)周數(shù)，直到動(dòng)脈粥樣硬化模型預(yù)評(píng)達(dá)標(biāo)。

1.2 血管標(biāo)本及血清的取材

1.2.1 摘除眼球法取血 1%戊巴比妥鈉0.1 mL/kg，腹腔注射麻醉。待小鼠翻身反應(yīng)消失，摘除眼球，將血液滴入含10%EDTA及抑肽酶的抗凝管內(nèi)。取血約1 mL。血液離心（3000 r/min，10 min）后，取血清至 Eppendorf管。

1.2.2 血管標(biāo)本的提取 取血完成后，使用手術(shù)剪剪開小鼠胸腔及腹腔。暴露心臟，在右心房剪1小口，用注射器穿入左心室，給予冰凍生理鹽水緩慢輸注灌洗，至肝臟及心肌顏色變白，右心房流出的液體基本變清亮為止。打開胸、腹腔，去除肺臟及腹腔內(nèi)器官。分離胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈血管全程，剪取主動(dòng)脈并以冰凍生理鹽水沖洗。每組小鼠取1根完整血管標(biāo)本縱向剖開，并染色，以觀察血管整體改變；其余全部血管置于-80℃冰箱中保存。

1.3 血脂水平的測(cè)定

將取材后血清送廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC含量。

1.4 主動(dòng)脈血管壁MiR-29b的表達(dá)

取出-80℃保存的主動(dòng)脈，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)血管的miR-29b表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的評(píng)估

高脂飼養(yǎng)15周后，兩組指標(biāo)的比較如下：FS組和NS組體重[（29.10±2.53）g 和（33.20±5.18）g]無明顯差異（P ＞0.05）；FS 組較 NS 組血清 TC[（13.52±1.58）mmol/L 和（2.12±0.35）mmol/L]顯著增高（P ＜ 0.01）。 見表 1。

表1 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的一般指標(biāo)比較（±s）

表1 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的一般指標(biāo)比較（±s）

注：與NS組比較，*P<0.01

FS組（n=8）NS 組（n=8）29.10±2.53*13.52±1.58 33.20±5.18 2.12±0.35組別 體重（g） 總膽固醇（mmol/L）

2.2 血管內(nèi)膜病理肉眼改變

剖開主動(dòng)脈弓可見：FS組內(nèi)膜面有淡黃色斑塊狀隆起，散在或融合成片，其長(zhǎng)軸多與血管長(zhǎng)軸平行，病變最明顯在血管分叉處；NS組，血管內(nèi)膜光滑、平整，無脂質(zhì)沉積。

2.3 蘇丹Ⅳ染色

FS組：主動(dòng)脈內(nèi)膜肉眼所見斑塊狀隆起處被染成猩紅色，整個(gè)被蘇丹Ⅳ染色部分呈片狀分布，與內(nèi)膜正常部分紅白分明；NS組血管內(nèi)膜光滑，幾乎不存在任何紅染，呈現(xiàn)內(nèi)膜本色（白色）。見圖1。

2.4 HE染色

圖1 主動(dòng)脈蘇丹Ⅳ染色

FS組：主動(dòng)脈血管內(nèi)膜明顯增厚，呈圓弧狀或新月狀凸起；可見大量胞漿內(nèi)含有大量脂質(zhì)空泡的泡沫細(xì)胞形成；內(nèi)彈性膜被破壞；中膜平滑肌增生明顯且不規(guī)則排列；NS組，主動(dòng)脈血管壁分層清晰，血管內(nèi)膜完整、光滑、無增厚；內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積；中膜平滑肌細(xì)胞規(guī)則整齊排列。見圖2。

以上指標(biāo)顯示該Apo-E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功。

2.5 主動(dòng)脈血管壁miR-29b的表達(dá)

FS組主動(dòng)脈弓miR-29b的表達(dá)較NS組明顯降低[平均吸光度值：（2.10±0.27）和（17.56±1.07）]明顯降低（P<0.01），提示在動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈中存在miR-29b的低表達(dá)。

3 討論

可能與心血管事件發(fā)生有密切相關(guān)的miRNAs目前證 實(shí) 有 ：miR-1、miR-126、miR-199、miR-29b、miR-30、miR-133等。MiR-29是新近發(fā)現(xiàn)的一類與纖維化疾病密切相關(guān)的小分子RNA家族。人類的miR-29的家族擁有3個(gè)成熟成員，分別為miR-29a、miR-29b和 miR-29c。MiR-29b含兩個(gè)基因編碼簇，其直接目標(biāo)至少有16個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)基因。miR-29b與促細(xì)胞分化和凋亡的調(diào)控[3-4]、心肌肥厚[5]的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Van Rooij等[6]指出，miR-29家族對(duì)急性心肌梗死后心肌組織纖維化的mRNA編碼，如：膠原蛋白、纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和彈性蛋白起抑制調(diào)控作用。Boon等[2]指出，miR-29可通過直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和調(diào)控多種與纖維化相關(guān)的信號(hào)通路參與纖維化過程。在小鼠和人類動(dòng)脈中，血管老化及年齡相關(guān)病變引起miR-29家族的顯著上調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)在Apo-E基因敲除小鼠主動(dòng)脈中，采取逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈技術(shù)對(duì)miR-29b的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在高脂飼養(yǎng)的Apo-E基因敲除小鼠的主動(dòng)脈中，形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；動(dòng)脈粥樣硬化血管中miR-29b表達(dá)減少，與血管壁老化導(dǎo)致miR-29b表達(dá)上升[2]相反。提示可能miR-29b對(duì)血管壁局部負(fù)性調(diào)控減弱，有利于動(dòng)脈粥樣硬化的形成；或者是動(dòng)脈粥樣硬化形成后產(chǎn)生對(duì)miR-29b表達(dá)的抑制所導(dǎo)致。

筆者推測(cè)在高脂喂食的Apo-E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，miR-29b低表達(dá)可能與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成有關(guān)。

[1]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，stress，and timing[J].Cell，2003，113（6）：673-676.

[2]Boon RA，Seeger T，Hevdt S，et al.MicroRNA-29 in aortic dilation：implications for aneurysm formation[J].Circ Res，2011，109（10）：1115-1119.

[3]Kriegel AJ，Liu Y，F(xiàn)ang Y，et al.The miR-29 family：genomics，cell biology，and relevance to renal and cardiovascular injury [J].Physiol Genomics，2012，44（4）：237-244.

[4]Chen KC，Wang YS，Hu CY，et al.OxLDL up-regulates microRNA-29b，leading to epigenetic modifications of MMP-2/MMP-9 genes：a novel mechanism for cardiovascular diseases[J].Faseb J，2011，5（5）：1718-1728.

[5]Cheng Y，Ji R，Yue J，et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart：do they play a role in cardiac hypertrophy[J].Am J Pathol，2007，170（6）：1831-1840.

[6]Van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（35）：13027-13032.