楊成明 滕 利 黃諳飛

1.廣東省深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院眼科，廣東深圳 518055；2.廣東省深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院病理科，廣東深圳 518055

角膜上皮位于眼角膜表面，是維持眼表正常生理功能的重要條件。健全的角膜上皮細(xì)胞是角膜抵御外界各種有害因素?fù)p傷的重要條件。人的角膜自我更新由位于角膜緣外圍區(qū)域的角膜緣干細(xì)胞來維持，結(jié)構(gòu)與功能健全的角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮再生的主要來源，當(dāng)角膜受到化學(xué)及熱燒傷，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病時，角膜緣上皮細(xì)胞將會缺失，導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險[1]。因此，重建完整的角膜上皮就顯得異常重要。

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES細(xì)胞）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得的，具有體外增殖和全能性兩大特點。近年來隨著ES細(xì)胞研究的不斷深入，其逐漸應(yīng)用于細(xì)胞、組織的修復(fù)和移植[2]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一種新型的報告基因，用GFP作為標(biāo)志物來標(biāo)記ES細(xì)胞，可用來追蹤ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化[3]。本研究利用質(zhì)粒pEGFP-N1脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染鼠ES細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)鼠ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為治療角膜損傷及重建角膜上皮提供細(xì)胞組織來源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼠ES細(xì)胞由北京大學(xué)深圳研究生院分子生物學(xué)實驗室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巰基乙醇、非必需氨基酸，購自Sigma公司；絲裂霉素C，購自Kogyo公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、G418，均購自Invitrogen公司；白血病抑制因子 （1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，購自Sigma公司；質(zhì)粒pEGFP-N1，購自Clontech公司；明膠、TaqDNA聚合酶，購自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托寶生物工程公司合成；免疫組化二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 ES細(xì)胞的培養(yǎng) ES 細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)絲裂霉素C滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）做飼養(yǎng)層培養(yǎng)，加入預(yù)先鋪有明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換ES細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM （內(nèi)含0.1 mol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺、150 mL/L 胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d傳代1次。

1.2.2 轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)ES細(xì)胞 將真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFPN1轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為實驗組，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為對照組。在轉(zhuǎn)染前2 h改為無血清的DMEM培養(yǎng)液；含載體pEGFP-N1質(zhì)粒的無血清DMEM培養(yǎng)液與含脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的無血清DMEM培養(yǎng)液混合，加入ES細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液，培養(yǎng)基為不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。G418篩選GFP陽性細(xì)胞克隆，接種在絲裂霉素C處理的MEF飼養(yǎng)層上，繼續(xù)擴增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。ES細(xì)胞誘導(dǎo)前去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，接種于涂抹明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，加入無LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，隔日換液，傳3～4代，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成角膜上皮細(xì)胞。

1.2.3 形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定 顯微鏡下觀察ES細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞基本融合，將培養(yǎng)分化的ES細(xì)胞用PBS洗滌3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加K14、K12及CD44單抗，4℃過夜，0.02%Triton-PBS洗滌，加人生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育40 min，PBS洗滌數(shù)次后，加入鏈親和素一過氧化物酶溶液，放置于室溫下10 min，0.02%Triton-PBS洗滌，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測 Trizol R試劑盒提取ES細(xì)胞總RNA，具體過程參照Trizol Reagent說明書。引物序列分別為：CD44正義鏈5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反義鏈5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）；K12 正義鏈 5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反義鏈 5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14 正義鏈 5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反義鏈 5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；內(nèi)參照 β-actin正義鏈 5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反義鏈 5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每個周期參數(shù)如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30個循環(huán)周期。采用小鼠角膜上皮細(xì)胞做陽性對照，每組PCR反應(yīng)均設(shè)一個陰性對照。取RT-PCR產(chǎn)物20 μL行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 ES細(xì)胞的形態(tài)

在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的ES細(xì)胞生長旺盛，邊界光滑，呈現(xiàn)巢狀生長，集落大多呈多角形或橢圓形，集落內(nèi)細(xì)胞排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。GFP陽性ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有微弱的綠色熒光（圖1～2）。

2.2 誘導(dǎo)分化的角膜上皮細(xì)胞形態(tài)

GFP陽性ES細(xì)胞經(jīng)Ⅳ型膠原誘導(dǎo)培養(yǎng)1周，可見在細(xì)胞集落中爬出上皮樣細(xì)胞，貼壁生長，增殖迅速，逐漸呈集落式生長，生長胞體多為扁平，呈多角型或不規(guī)則形態(tài)生長，表現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有很強的綠色熒光（圖3～4）。

2.3 K12、K14及CD44表達(dá)情況

圖1 光鏡下的ES細(xì)胞（×100）

圖2 熒光顯微鏡下GFP未轉(zhuǎn)染的ES 細(xì)胞（×100）

圖3 誘導(dǎo)后的角膜上皮樣細(xì)胞（×100）

圖4 GFP轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)的角膜上皮樣細(xì)胞（×100）

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)分化的ES細(xì)胞中有K12及CD44表達(dá)，而K14則無表達(dá)，證實轉(zhuǎn)染后ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化（圖5）；免疫組化結(jié)果顯示：角膜上皮樣細(xì)胞K14的表達(dá)很少，而K12及CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性（圖6）。

圖5 K12、K14及CD44 RT-PCR表達(dá)情況

圖6 K12、K14及CD44免疫組化結(jié)果

3 討論

嚴(yán)重的角膜損傷一直是眼科治療的難題。一些嚴(yán)重的化學(xué)或熱燒傷，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常導(dǎo)致角膜上皮的大量缺失。傳統(tǒng)的移植方法雖有一定療效，但由于供體缺乏、移植免疫及倫理等問題，在臨床上的應(yīng)用發(fā)展受到很大限制[4]。重建角膜的關(guān)鍵是獲得足夠的角膜上皮材料。本研究探索采用誘導(dǎo)有多向分化潛能的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為角膜上皮移植提供無限的供體來源。

ES細(xì)胞是一種具有全能性、可無限增殖和多向分化潛能的未分化細(xì)胞，具有兩個重要特性：①自我更新潛能。干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下可不斷增殖，從而可自我更新。②多向分化潛能。在體內(nèi)外ES細(xì)胞均有分化成許多特定細(xì)胞類型的能力。它能遷移到不同部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，恢復(fù)受損細(xì)胞的功能，成為一種新型細(xì)胞替代治療和基因治療的途徑。經(jīng)絲裂霉素C處理的含LIF的MEF作為飼養(yǎng)層，能夠抑制ES細(xì)胞的分化和促進(jìn)其增殖，并使其保持未分化狀態(tài)以及多向分化潛能[5]。本研究將Ⅳ型膠原作為誘導(dǎo)劑，加入不含LIF的培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化。

GFP是一種由238個氨基酸組成的蛋白，作為熒光標(biāo)記分子，在研究細(xì)胞的分化、細(xì)胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂質(zhì)體方法將含有GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠ES細(xì)胞中，選擇G418篩選并純化后的GFP陽性ES細(xì)胞。將這些能夠持續(xù)表達(dá)GFP的ES細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下分化成角膜上皮樣細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)GFP，證明GFP基因已完全整合到ES細(xì)胞基因組中，這對ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化、遷移及整合具有重要意義。

本研究對誘導(dǎo)分化后的ES細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞符合具有典型上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞呈集落式生長，排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。對于眼表上皮而言，區(qū)分角膜上皮細(xì)胞與結(jié)膜上皮細(xì)胞是非常重要的，因為它們在功能上有很大區(qū)別，影響角膜上皮組織的移植。細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）是細(xì)胞骨架成分中間絲的重要組成部分，是一類在上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)，也是某些上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志物，其中，K14主要在結(jié)膜上皮表達(dá)而不在角膜上皮表達(dá)，K12則是在角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的角蛋白，是特異性角膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物。而CD44也存在于角膜上皮細(xì)胞中，功能與組織修復(fù)有關(guān)，它可以促進(jìn)角膜上皮的愈合。本實驗誘導(dǎo)分化的上皮細(xì)胞CD44和K12表達(dá)陽性，而表達(dá)K14陰性，說明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞，而非結(jié)膜上皮細(xì)胞。提示ES細(xì)胞能在體外定向誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測ES細(xì)胞及分化的角膜上皮樣細(xì)胞中均有K12及CD44的表達(dá)，而結(jié)膜上皮標(biāo)志物K14則無表達(dá)，證實轉(zhuǎn)染GFP后的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化。

總之，通過以上實驗本研究成功建立了轉(zhuǎn)染GFP基因的ES細(xì)胞系，并利用Ⅳ型膠原體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為角膜上皮樣細(xì)胞，為臨床治療角膜損傷提供新的材料來源。

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