張 輝 劉俊峰 黃軍華 張平方

華北油田總醫(yī)院骨科，河北任丘 062552

股骨頭壞死是骨科較為常見的一種疾病，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。在我國由于存在廣泛的糖皮質(zhì)激素不合理應(yīng)用，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率尤為突出。有研究顯示，在長期大劑量激素的應(yīng)用會(huì)造成股骨頭局部血管通透性改變以及血管活性物質(zhì)異常分泌，進(jìn)而引起血流減緩、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及微血栓形成，最終導(dǎo)致局部骨組織正常結(jié)構(gòu)的破壞，并且其范圍和嚴(yán)重程度與血管內(nèi)皮的損傷程度具有明顯的相關(guān)性[1]。而在維持血管內(nèi)皮的正常結(jié)構(gòu)和功能中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC），其數(shù)量和功能的下調(diào)參與了該疾病的進(jìn)程。由于辛伐他汀能夠顯著改善EPC的功能狀態(tài)，本研究采用辛伐他汀對(duì)激素性股骨頭壞死患者進(jìn)行治療，并對(duì)其循環(huán)EPC數(shù)量和功能進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇華北油田總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科2010年2月～2012年10月診治的激素性股骨頭壞死患者24例，隨機(jī)分為治療組及對(duì)照組，每組各12例。所有入選病例均符合股骨頭壞死診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。另選擇我院健康體檢者12例為正常組。各組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2（瑞士Lonza公司）；FITC標(biāo)記的血凝素（FITC-lectin，美國 Sigma公司）；DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?（DiI-acLDL，美國Molecular Probes公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國 Duchfo公司）；纖維連結(jié)蛋白（fibronectin，美國 Hematological Technologies公司）；淋巴細(xì)胞分離液（天津TBD公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治療方法及療效評(píng)價(jià) 對(duì)照組患者予避免負(fù)重及相應(yīng)的功能鍛煉，并以常規(guī)劑量規(guī)律的服用腸溶性阿司匹林和地巴唑。治療組患者在此基礎(chǔ)上予口服辛伐他汀（山東羅欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20065119）進(jìn)行治療，0.01 g/d，連續(xù)應(yīng)用12周。治療前后分別對(duì)兩組患者進(jìn)行Harris評(píng)分以評(píng)價(jià)各組的臨床療效。

1.3.2 循環(huán)EPC體外培養(yǎng)及鑒定[3]所有患者治療前后于清晨空腹采集靜脈血20 mL，經(jīng)過密度梯度離心分離收集單個(gè)核細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌離心后，以EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為1×107個(gè)/mL，將其接種至包被有纖連蛋白的24孔板中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。第3天以PBS洗去未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并予隔日半量換液。第7天加入終濃度0.005 g/L的DiI-acLDL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2%多聚甲醛固定后，加入0.005 g/L的FITC-lectin于37℃孵育1 h，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察熒光表達(dá)情況，雙熒光陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是EPC。

1.3.3 細(xì)胞增殖能力檢測 細(xì)胞培養(yǎng)第7天時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，加入 96 孔板中（0.2 mL/孔），在 5%CO2、37℃培養(yǎng) 92 h 后加入 5 g/L 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（20 μL/孔）。培養(yǎng) 4 h 后吸棄培養(yǎng)基，并加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩溶解后用酶標(biāo)儀檢測其570 nm處的吸光度（A值）。

1.3.4 黏附能力檢測 細(xì)胞培養(yǎng)第7天時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL，將其加入包被纖維連結(jié)蛋白的24孔板中（1 mL/孔），常規(guī)培養(yǎng)30 min后PBS沖洗3遍，200×相差顯微鏡下選取3個(gè)不同視野對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3.5 細(xì)胞遷移能力檢測 細(xì)胞培養(yǎng)第7天時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用0.1%血清濃度、無細(xì)胞因子的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL，加入24孔板插入式培養(yǎng)皿（0.2 mL/孔），在24孔板中加入EGM-2完全培養(yǎng)基（0.6 mL/孔），并將插入式培養(yǎng)皿置于其中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)皿去除內(nèi)層細(xì)胞，1%多聚甲醛固定外層細(xì)胞并行結(jié)晶紫染色，200×相差顯微鏡下選取3個(gè)不同視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效評(píng)價(jià)

治療前治療組 Harris評(píng)分為（76.32±3.97）分，對(duì)照組為（78.29±4.13）分，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.263，P＞0.05）。經(jīng)辛伐他汀治療 12周后，治療組 Harris評(píng)分[（93.47±4.06）分]較對(duì)照組[（87.63±3.59）分]有明顯的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.427，P＜0.05）。

2.2 EPC培養(yǎng)及鑒定

外周血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)7 d后可以呈短梭狀的細(xì)胞生成，具有典型EPC的形態(tài)特征，并且這些細(xì)胞同時(shí)具有攝取DiI-acLDL和結(jié)合FITC-lectin的能力，經(jīng)Image J軟件進(jìn)行圖像疊加后該類細(xì)胞呈現(xiàn)出雙陽性的黃色熒光（圖1）。

圖1 EPC的免疫熒光鑒定

2.3 EPC增殖能力的變化

MTT實(shí)驗(yàn)顯示，正常組循環(huán)EPC在570 nm處的吸光度為（0.76±0.13），而治療組及對(duì)照組分別為（0.52±0.14）和（0.53±0.17），均低于正常組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.73、4.95，均P＜0.01），且治療組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.34，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外增殖能力顯示，其在570 nm處的吸光度為（0.72±0.15），明顯高于對(duì)照組（0.62±0.11），二者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.76，P＜0.01）。

2.4 EPC黏附能力的變化

正常組EPC在體外培養(yǎng)30 min后的貼壁細(xì)胞數(shù)為（13.42±3.15）個(gè)/HPF，而治療組與對(duì)照組分別為（5.93±1.67）個(gè)/HPF 和（5.67±1.58）個(gè)/HPF，均少于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.68、4.37，均 P＜0.01），且治療組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.24，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外黏附能力顯示，其貼壁細(xì)胞數(shù)為（11.93±3.45）個(gè)/HPF，明顯多于對(duì)照組[（8.51±3.63）個(gè)/HPF]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.26，P＜0.01）。

2.5 EPC遷移能力的變化

正常組EPC在24孔插入式培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)24 h后，遷移至皿外層的細(xì)胞數(shù)量為（13.62±3.73）個(gè)/HPF，而治療組與對(duì)照組分別為（6.28±1.53）個(gè)/HPF 和（6.64±1.75）個(gè)/HPF，均少于正常組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.32、4.66，均P＜0.01），且治療組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.22，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外遷移能力顯示，其遷移至皿外側(cè)的細(xì)胞數(shù)為 （10.56±3.09）個(gè)/HPF，明顯多于對(duì)照組[（7.48±3.13）個(gè)/HPF]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.37，P＜0.01）。

3 討論

盡管糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可，然而對(duì)于激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制卻尚無定論。近年來，有研究顯示，股骨頭局部毛細(xì)血管密度的增加可以顯著的降低股骨頭缺血性壞死的發(fā)生[4]，由此有學(xué)者認(rèn)為，血管性因素有可能在股骨頭壞死的病理生理機(jī)制中起到了關(guān)鍵性的作用[5]。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞前體的EPC主要定居于骨髓，僅有極少量存在于外周血中，它不僅參與了血管生成及再生，同時(shí)在特定的狀態(tài)下，可以遷移并歸巢至發(fā)生損傷的血管部位，在血管損傷后的修復(fù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]，其數(shù)量及功能的變化對(duì)于血管相關(guān)性疾病的評(píng)估亦具有一定的價(jià)值。

相關(guān)的研究顯示，在激素的長期使用可以在體內(nèi)通過多種途徑對(duì)EPC的數(shù)量和功能產(chǎn)生影響[7]。一方面激素可以對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生的直接損傷作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡，另一方面激素的使用可以顯著降低體內(nèi)一氧化氮及血管內(nèi)皮生長因子等血管活性物質(zhì)合成，進(jìn)而使EPC的增殖、遷移能力和血管生成能力減低[8-9]。諸多方面因素共同作用的結(jié)果將有可能導(dǎo)致在激素長期應(yīng)用過程中循環(huán)EPC數(shù)量和功能的改變，進(jìn)而造成股骨頭局部由于血管數(shù)量及功能的異常而發(fā)生骨細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)受到抑制而產(chǎn)生凋亡甚至壞死。本研究對(duì)激素性股骨頭壞死患者的循環(huán)EPC包括增殖、黏附、遷移能力在內(nèi)的各項(xiàng)功能指標(biāo)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示與正常人群相比，激素性股骨頭壞死患者循環(huán)EPC的體外功能指標(biāo)存在不同程度的下調(diào)。由此推測，在激素長期大量應(yīng)用的過程中，由于其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害導(dǎo)致股骨頭局部微血管內(nèi)皮細(xì)胞的壞死脫落，而在血管損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵性作用的EPC由于多種細(xì)胞因子的分泌受到抑制而使其數(shù)量減少，且嚴(yán)重影響了其功能的有效發(fā)揮，最終使得受損的血管內(nèi)皮不能得到及時(shí)有效的修復(fù)而發(fā)生舒張功能受損，甚而造成局部微血栓的形成及血管的閉塞，從而影響股骨頭局部的正常血液供應(yīng)而導(dǎo)致骨質(zhì)的廣泛性破壞和結(jié)構(gòu)的改變。

辛伐他汀具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化等非調(diào)脂作用，作為臨床廣泛應(yīng)用的高效降脂藥物廣泛地應(yīng)用于多種心血管疾病。同時(shí)近年來其特有的改善EPC功能的作用也越來越受到人們的廣泛關(guān)注，研究顯示，他汀類藥物能夠促進(jìn)EPC的動(dòng)員、遷移及分化，有利于改善EPC的功能，促進(jìn)缺血區(qū)域的血管新生[10]。并且其對(duì)激素性股骨頭壞死的臨床療效亦有報(bào)道[11]。在本研究中，利用辛伐他汀對(duì)激素性股骨頭壞死患者進(jìn)行了治療，結(jié)果顯示，辛伐他汀的確對(duì)于激素性股骨頭壞死患者的臨床癥狀改善有所幫助，治療組在應(yīng)用辛伐他汀12周后其循環(huán)EPC的各項(xiàng)體外功能指標(biāo)均較對(duì)照組存在明顯上調(diào)，與之相應(yīng)的Harris評(píng)分也較對(duì)照組有顯著的提高。這表明辛伐他汀能夠通過改善激素性股骨頭壞死患者循環(huán)EPC的功能，發(fā)揮其對(duì)股骨頭局部微血管的修復(fù)功能，有效地改善股骨頭的局部血液供應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)股骨頭壞死的治療作用。

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