聶 宇 劉 銳 顧海勇 何 鋒 張 輝 劉瑞平 張 浩

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇常州 213003

在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控發(fā)揮了重要作用；凋亡異常是導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育的重要因素之一[1]。半胱天冬蛋白酶8（Caspase8）是一種細(xì)胞凋亡半胱天冬蛋白酶前體；Caspase8基因敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致心肌缺陷并在胚胎期死亡，提示該蛋白酶與心臟發(fā)育密切相關(guān)[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，編碼人類半胱天冬蛋白酶的基因Caspase8存在功能性多態(tài)性位點(diǎn)rs3769818 C＞T，并與多類疾病的易感性相關(guān)[3]，但尚未有針對(duì)Caspase8 rs3769818 C＞T基因多態(tài)性與先心病易感性的相關(guān)研究。

先天性心臟病是新生兒致病和死亡的主要原因之一，在新生兒中的發(fā)病率約為1%[4-7]。多數(shù)先心病是遺傳與環(huán)境交互作用的結(jié)果；目前，已經(jīng)有大量研究人員開(kāi)始關(guān)注不同遺傳背景個(gè)體在先性心病易感性方面的差異，其中單核苷酸多態(tài)性（SNP）是個(gè)體遺傳差異的一個(gè)重要因素。鑒于Caspase8在心臟發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵作用，探索先心病患兒中Caspase8 rs3769818 C＞T攜帶情況，對(duì)于理解先心病發(fā)病機(jī)制有重要意義。本研究對(duì)大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（transpositionof the great arteries，TGA）和法洛四聯(lián)征（tetralogy of Fallot，TOF）兩類圓錐動(dòng)脈干畸形先心病患兒，以及正常對(duì)照人群利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)對(duì)Caspase8 rs3769818 C＞T基因型和等位基因差異進(jìn)行了比較分析，進(jìn)而探討Caspase8基因與先天性心臟病發(fā)生的相關(guān)性。

表1 三組一般資料比較

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)照組136例，為2009年12月～2011年7月在鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院和常州市第二人民醫(yī)院的非先天性疾病患者。病例組244例（其中TOF組120例，TGA組124例），為同一時(shí)期在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院收集。所有對(duì)象均為漢族人群，病例組與對(duì)照組年齡、性別差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所涉內(nèi)容已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)評(píng)審，在樣本采集過(guò)程中所有研究對(duì)象均由法定監(jiān)護(hù)人代理簽署知情同意書，研究對(duì)象及其法定監(jiān)護(hù)人對(duì)研究知情同意。TOF組平均年齡（1.55±0.70）歲，TGA組平均年齡（2.27±0.49）歲，對(duì)照組平均年齡（1.58±0.61）歲；TGA組中30.6%為女性，TOF組中38.3%為女性，對(duì)照組中38.2%為女性。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示年齡性別匹配較好。見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

獲取知情同意后，進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查調(diào)查相關(guān)背景資料。受試人群空腹采集2 mL（EDTA抗凝），1 h內(nèi)4000 r/min離心10 min，分離白細(xì)胞。運(yùn)用Qiagen DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞DNA，進(jìn)行分裝低溫凍存。運(yùn)用美國(guó)Sequenom公司的MassARRAYTM Analyzer技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行SNP分型，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。結(jié)果由MassARRAYRT軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)讀取，MassARRAY Typer 4.0軟件完成基因分型分析。為驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確度，10%的樣本接受重復(fù)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成。病例組與對(duì)照組的基本特征進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和（或）t檢驗(yàn)；采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）（表示 Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性位點(diǎn)變異型與野生型純合型比較，導(dǎo)致先心病發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度）。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn)

將對(duì)照人群Caspase8 rs3769818 C＞T位點(diǎn)的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果提示P值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P=0.951）， 說(shuō)明該人群Caspase8 rs3769818 C＞T位點(diǎn)基因型頻率處于平衡狀態(tài)，具有群體代表性。

2.2 SNP位點(diǎn)質(zhì)譜分型

基于MALDI-TOF的質(zhì)譜分型結(jié)果顯示，對(duì)Caspase8 rs3769818 C＞T等位基因的分型結(jié)果良好可信，TOF組，TGA組和對(duì)照組CC基因型共193例，CT基因型共146例，TT基因型共36例，分型失敗共5例，分型成功率達(dá)到98.68%（圖1），能夠用于進(jìn)一步的相關(guān)性分析。

圖1 Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性位點(diǎn)質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）分型圖

2.3 Caspase8 rs3769818 C＞T位點(diǎn)基因型分布與先心病易感性關(guān)系

在單個(gè)位點(diǎn)的分析中，筆者發(fā)現(xiàn)TOF及TGA病例和對(duì)照中Caspase8 rs3769818 C＞T位點(diǎn)發(fā)生頻率差異不明顯。Logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與攜帶Caspase8 rs3769818 CC基因型的個(gè)體相比較，Caspase8 rs3769818 CT基因型攜帶者與先心病（TGA和TOF）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不存在明確相關(guān)性 （TOF OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）和（TGA OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）（表2）；攜帶Caspase8 rs3769818 TT基因型與TOF及TGA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)（TOF OR=1.17，95%CI=0.45～2.98；P=0.751）和（TGA OR=1.86，95%CI=0.79～4.41；P=0.157）（表2）。在顯性模型和隱性模型中，Caspase8 rs3769818 C＞T各基因型與TOF及TGA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)（表2）。

表2 Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性和先天性心臟病危險(xiǎn)關(guān)系的Logistic回歸分析

3 討論

Caspase8多態(tài)性與腫瘤等多種疾病易感性相關(guān)[9-12]，但對(duì)Caspase8多態(tài)性與先天性心臟病易感性的研究尚無(wú)報(bào)道。本文以兩種圓錐動(dòng)脈干畸形先心?。═GA和TOF）為對(duì)象，研究了Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性位點(diǎn)與中國(guó)人群先天性心臟病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分型及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性與先天性心臟病TGA和TOF的發(fā)病危險(xiǎn)性無(wú)明確關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示Caspase8 rs3769818 C＞T最小等位基因型頻率（minor allele frequency，MAF）為0.274，該頻率與Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的亞洲人群相應(yīng)位點(diǎn)的基因型分布無(wú)明顯差異（T：0.300），同時(shí)對(duì)照基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P=0.951）；說(shuō)明對(duì)照人群選擇具有代表性。

需要指出的是，盡管本研究結(jié)果提示Caspase8 rs3769818 C＞T與先心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明確相關(guān)性，但本研究樣本量不大，并且是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，不能完全排除選擇偏倚。另一方面，先心病的發(fā)生也可能與母親基因型的關(guān)系更大，但本研究沒(méi)有涉及母親Caspase8 rs3769818 C＞T多態(tài)性與子代先心病易感性的關(guān)系，也缺乏凋亡相關(guān)其他基因以及基因-基因相互作用的研究。未來(lái)，我們需要在不同人群中進(jìn)行大樣本的研究再加以功能學(xué)驗(yàn)證方可能獲得更為明確的答案。

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