許雷鳴 武 谷 顧 倩

1.安徽省食品藥品檢驗所，安徽合肥 230051；2.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241000

門冬氨酸鳥氨酸注射液為肝膽疾病輔助用藥，臨床上主要用于因急、慢性肝?。ㄈ绺餍透窝住⒏斡不⒅靖?、肝炎后綜合征）引發(fā)的血氨升高及治療肝性腦病，尤其適用于治療肝昏迷早期或肝昏迷期的意識模糊狀態(tài)。國內(nèi)市場上已有本品的進(jìn)口藥品，目前尚無國內(nèi)藥廠的門冬氨酸鳥氨酸注射液上市。門冬氨酸鳥氨酸注射液的國家食品藥品監(jiān)督管理局進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)采用家兔法進(jìn)行熱原檢查，本實(shí)驗根據(jù) 《中國藥典》2010年版二部 “細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[1]99-101和“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[1]212-213，以及相關(guān)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的文獻(xiàn)[2-12]，對門冬氨酸鳥氨酸注射液應(yīng)用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性進(jìn)行了研究并建立了門冬氨酸鳥氨酸注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VS-1300L-U 潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），S648 恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠），XW-80A 混旋儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），微量取液器（50～250 μL，上海榮泰生化工程有限公司），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具（湛江博康海洋生物有限公司），智能熱原儀（天津大學(xué)無線電廠精密儀器廠，ZRY-2D型）。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：11102021，規(guī)格：100 mL/瓶）。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）（中國食品藥品檢定研究院，效價：120 EU/支，批號：150601-201072）。

1.4 鱟試劑與家兔

鱟試劑（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：11091912，靈敏度：0.25 EU/mL，規(guī)格：0.1 mL/支；湛江博康海洋生物有限公司，批號：1112010，靈敏度：0.25 EU/mL，規(guī)格：0.1 mL/支）；新西蘭兔，普通級，體重1.7 kg 以上，購自南京青龍山動物繁殖場，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2007-0008。

1.5 藥品

門冬氨酸鳥氨酸注射液（規(guī)格：10 mL∶5 g，批號：110901，110902，110903， 由合肥一公司生產(chǎn)； 規(guī)格：10 mL∶5 g，批號：010571，010581，010591，由德國麥?zhǔn)洗笏帍S生產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

按《中國藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]對兩個廠家的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，2λ管均為陽性，0.25λ管和陰性對照管均為陰性，兩個不同廠家的2 批鱟試劑靈敏度測定值均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，符合要求，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.2 內(nèi)毒素限值（L）的確定[1-4]

參照藥品說明書，門冬氨酸鳥氨酸注射液臨床用法用量如下：在使用前應(yīng)該用注射用溶液稀釋，然后經(jīng)靜脈輸入。由于靜脈耐受方面的原因，每500 毫升溶液中不要溶解超過6 安瓿該藥物，輸入速度最大不要超過每小時1 安瓿該藥物。根據(jù)公式 L=K/M，注射劑 K=5 EU/（kg·h），式中M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按60 kg 計算，則 L=30 EU/mL，根據(jù)《中國藥典》2010年版二部“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[2]，由于藥物和適應(yīng)證（如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥、兒童老人用藥、復(fù)合用藥、大輸液等）的不同，限值可適當(dāng)嚴(yán)格，至計算值的1/3～1/2，以保證安全用藥，所以最終確定限值（L）為 1/3×30 EU/mL=10 EU/mL。

2.3 干擾試驗預(yù)試驗

根據(jù)公式MVD=C×L/λ，目前市售鱟試劑λ通常在0.50～0.03 EU/mL，則門冬氨酸鳥氨酸注射液對應(yīng)的最大有效稀釋倍數(shù)分別為 20、40、80、160、320 倍。取樣品一批（批號：110901），將門冬氨酸鳥氨酸注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別配制成為原液、10、20、40、80倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC。同法制備上述系列溶液，在其中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的溶液中均含有2λ（0.50 EU/mL）濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取2個廠家的鱟試劑分別與上述NPC 和PPC 進(jìn)行反應(yīng)，混勻后封口，置37℃恒溫水浴60 min。每一濃度重復(fù)2 管，并設(shè)陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。干擾試驗預(yù)試結(jié)果見表2。預(yù)試結(jié)果表明，樣品在20倍以下稀釋倍數(shù)時可能對反應(yīng)有抑制性干擾作用；樣品的20倍以上稀釋倍數(shù)可能對反應(yīng)無干擾作用。

表2 門冬氨酸鳥氨酸注射液干擾試驗預(yù)試結(jié)果

2.4 干擾試驗

為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，取門冬氨酸鳥氨酸注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別進(jìn)行稀釋，使其正式干擾試驗稀釋倍數(shù)為20倍，按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”凝膠法干擾試驗項進(jìn)行試驗，結(jié)果見表3。正式干擾試驗結(jié)果表明，采用福州新北生化工業(yè)有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗，Es均在0.5λ～2.0λ 內(nèi)且Et/Es均在0.5～2.0 之間，確認(rèn)樣品稀釋20倍后對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

表3 門冬氨酸鳥氨酸注射液干擾試驗結(jié)果

2.5 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草

取本品，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XIE），每1 毫升中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于10 EU。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查與家兔熱原檢查的對比試驗

根據(jù)“2.4”項下結(jié)果，取兩個廠家6 批樣品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋20倍后，分別用兩個不同廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑按本研究起草的標(biāo)準(zhǔn)和 《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”凝膠限度試驗對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果6 批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合起草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。另取此6 批樣品，按照門冬氨酸鳥氨酸注射液的進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20020348，每1 千克家兔體重注射1.0 mL，分別按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪD“熱原檢查法”進(jìn)行熱原檢查，結(jié)果6 批樣品均符合規(guī)定。對比試驗表明門冬氨酸鳥氨酸注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與家兔熱原檢查法的檢查結(jié)果一致。

3 討論

目前，常見的熱原檢查方法為家兔法和鱟試劑法。與傳統(tǒng)的家兔熱原檢查法相比，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有操作簡便，檢驗周期短，結(jié)果準(zhǔn)確，檢測靈敏度高，符合對實(shí)驗動物減少、替代、優(yōu)化的3R 原則等優(yōu)點(diǎn)。鱟試劑法關(guān)鍵內(nèi)容是確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值，建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。不同廠家的鱟試劑在工藝、質(zhì)量等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異，通過采用2個不同廠家的鱟試劑對2個廠家共6個批號的門冬氨酸鳥氨酸注射液樣品進(jìn)行試驗，可客觀地評價樣品濃度對鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的干擾程度，確定對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的樣品濃度范圍。結(jié)果表明：本品稀釋20倍以后對內(nèi)毒素檢查無干擾，可進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。根據(jù)試驗結(jié)果和臨床實(shí)際應(yīng)用情況，可以確定門冬氨酸鳥氨酸注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法如下：取本品，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XIE），每1 毫升中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于10 EU。此可為門冬氨酸鳥氨酸注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可代替家兔熱原檢查法用于門冬氨酸鳥氨酸注射液的質(zhì)量控制。

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