田 明 丁治國 陳振宙 魯香鳳 王 廣

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院普外科，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理科，北京 100700

大承氣湯治療急性胰腺炎的療效已得到廣大臨床工作者的認(rèn)同。研究證明大承氣湯有促進(jìn)腸蠕動、防止腸道細(xì)菌及毒素移位、控制全身炎癥反應(yīng)綜合征、抑制促炎因子等作用[1]。細(xì)胞凋亡或者壞死是胰腺自身消化、微循環(huán)障礙、炎性介質(zhì)等多個因素作用于胰腺細(xì)胞后產(chǎn)生的最終影響，被認(rèn)為是急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的終末效應(yīng)階段[2]。如細(xì)胞以凋亡方式死亡，則不引起炎癥反應(yīng)及胰外臟器功能損害，而只出現(xiàn)輕型胰腺炎。目前，大承氣湯對急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響仍為空白。因急性胰腺炎可延緩胃排空，造成惡心、嘔吐，經(jīng)空腸給藥可有效避免嘔吐導(dǎo)致給藥失敗。本實驗建立急性重癥胰腺炎大鼠模型，觀察空腸內(nèi)注入大承氣湯對急性胰腺炎大鼠細(xì)胞因子的影響和胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物雄性SD大鼠，數(shù)目90只，體重250～280 g。大承氣湯（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房提供），配方為大黃 12 g、枳實 12 g、厚樸 15 g、芒硝 9 g，煎為 200 mL。

1.2 實驗分組

大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組各30例。假手術(shù)組僅行開腹、經(jīng)胃造口置空腸管術(shù)。模型組采用3.5%?；悄懰徕c胰周注射法制造大鼠急性胰腺炎模型，假手術(shù)組和模型組術(shù)后2 h 一次性空腸內(nèi)注入10 mL 生理鹽水。治療組在模型組基礎(chǔ)上術(shù)后2 h 按10 mL/kg的劑量一次性空腸內(nèi)注入大承氣湯。

1.3 實驗方法

大鼠術(shù)前空腹12 h，按分組標(biāo)記后，稱重。用10%水合氯醛（400 mg/kg 體重）腹腔注射麻醉，開腹。假手術(shù)組大鼠：開腹后，行胃造瘺術(shù)，然后經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm硅膠管于空腸上段2.0cm處，關(guān)腹。模型組及治療組大鼠：開腹后，用1 mL 注射器向胰周被膜內(nèi)勻速注射3.5%?；悄懰徕c約1 mL，使整個胰腺均勻隆起。然后經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm 硅膠管于空腸上段2.0cm處。檢查無消化道漏，關(guān)腹。各組大鼠術(shù)后10～15 min 清醒后限制飲水，籠中自由活動。術(shù)后2 h，治療組按10 mL/kg的劑量經(jīng)造瘺硅膠管一次性空腸內(nèi)注入大承氣湯，假手術(shù)組和模型組經(jīng)造瘺硅膠管一次性空腸內(nèi)注入相應(yīng)體積的生理鹽水。給藥24 h后開腹，腹主動脈取血1 mL，于4℃下離心10 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min。取上清，分裝凍存于-80℃冰箱。切取胰腺標(biāo)本，置20%中性磷酸鹽緩沖液-甲醛中固定，送組織病理檢查。

1.4 檢測方法

1.4.1 檢測項目及方法 大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 18（IL-18）集中采用 ELISA 法檢測 TNF-α、IL-1β、IL-18 濃度變化。

1.4.2 胰腺炎組織損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn) 胰腺組織病理學(xué)積分采用改良Grewal 法[3]對胰腺炎組織損傷進(jìn)行定量評估，病理評分標(biāo)準(zhǔn)如下。①水腫：0分，無水腫；1分，胰腺小葉間隙增寬；2分，重度葉間隙增寬；3分，腺泡間隙增寬；4分，細(xì)胞間隙增寬。②炎癥：以每個高倍視野（HPF）中的炎性細(xì)胞數(shù)計算，每5個炎細(xì)胞計0.5分，超過30個計4分。③出血：以每個 HPF 計算，0分，無出血；1分，1～2個出血點；2分，3～4 個出血點；3 分，5～6 個出血點；4 分，7～8個或更多出血點。④壞死程度：以每個HPF 計壞死細(xì)胞數(shù)，0分，1～4個/HPF；1 分，5～8 個/HPF；2 分，9～12 個/HPF；3 分，13～16 個/HPF；4分，17個以上或廣泛融合的壞死。連續(xù)觀察8～10個視野，根據(jù)各個視野的水腫、炎癥、出血和壞死各類積分分別計算均數(shù)；各均數(shù)相加得每只大鼠的病理積分總分。

1.4.3 計算胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù) 每個大鼠的胰腺石蠟標(biāo)本塊取8個切片，每張切片選取8個陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞和其中的凋亡細(xì)胞，計算800個腺泡細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比作為每只大鼠胰腺組織的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/800×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡情況

模型組死亡3例，治療組死亡2例，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組大鼠無死亡。

2.2 外周血細(xì)胞因子、病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)的結(jié)果

治療組 IL-1β、IL-18、TNF-α 濃度均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和治療組病理學(xué)積分均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），表明造模成功；治療組病理學(xué)積分低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療組凋亡指數(shù)大于模型組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

急性胰腺炎是外科常見急腹癥，屬祖國醫(yī)學(xué)“腹痛”、“膈痛”、“胃脘痛”、“脾心痛”之范疇，以上腹部急性疼痛為主癥。以氣滯血瘀、毒瘀互結(jié)為病理特點[4]。輕型胰腺炎易于治療，預(yù)后好；重癥胰腺炎病情兇險，常伴其他臟器功能損害，預(yù)后差，病死率高。如何在急性胰腺炎早期控制其病情進(jìn)展，預(yù)防急性胰腺炎向重癥胰腺炎發(fā)展，減輕重癥胰腺炎壞死范圍等是被研究者廣泛關(guān)注的問題。研究者發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎起病初期，各類損傷因素?fù)p傷胰腺腺泡細(xì)胞。如胰腺腺泡細(xì)胞死亡以壞死方式為主，則引發(fā)炎癥反應(yīng)，繼而觸發(fā)白細(xì)胞系統(tǒng)何細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)放大反應(yīng)，損傷其他臟器，誘發(fā)多臟器功能衰竭，從而導(dǎo)致重癥胰腺炎的發(fā)生；如胰腺腺泡細(xì)胞死亡以凋亡方式為主，則不會引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和其他臟器損害，表現(xiàn)為輕型胰腺炎[5]。目前，早期應(yīng)用藥物干預(yù)來誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡是治療急性胰腺炎新的研究熱點。

表1 各組細(xì)胞因子濃度和病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)結(jié)果比較（pg/mL，±s）

表1 各組細(xì)胞因子濃度和病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)結(jié)果比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.01；IL-1β：白介素1β；IL-18：白介素18；TNF-α：腫瘤壞死因子α

組別 例數(shù) IL-1β IL-18 TNF-α 病理學(xué)積分（分）凋亡指數(shù)（%）假手術(shù)組模型組治療組F值P值30 27 28 51.29±10.91 170.45 ±26.74 1，58.61±21.31a 299.01＜0.01 49.06±11.76 230.67 ±89.52 187.78±67.28a 63.82＜0.01 15.10 ±5.35 72.26±16.58 58.32 ±12.17a 175.70＜0.01 0.32±0.10 8.46±2.97b 7.24 ±1.31ab 166.08＜0.01 0.79±0.11 4.10±1.79 7.67 ±3.13c 80.73＜0.01

細(xì)胞因子是由體內(nèi)免疫細(xì)胞等主動分泌的一組小分子量可溶性蛋白及多肽。細(xì)胞因子正常生理狀態(tài)下表達(dá)較少。當(dāng)有內(nèi)、外界各種致炎因素刺激時，免疫系統(tǒng)被激活，免疫細(xì)胞分泌出大量細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-18是目前研究最充分的致炎因子，在急性胰腺炎早期，即可發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和IL-18的表達(dá)增強(qiáng)，且與急性胰腺炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為判斷急性胰腺炎預(yù)后的根據(jù)[6]。

其中，血清TNF-α對細(xì)胞凋亡調(diào)控表現(xiàn)出雙面性，即低濃度的TNF-α能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎癥愈合；而高濃度的TNF-α則導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞壞死。一方面，TNF-α通過與其受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，TNF-α激發(fā)一系列級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，引起胰腺及胰腺外組織器官損傷甚至壞死。此外，抑制血清IL-1β和IL-18的水平可以促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，減輕胰腺的炎癥反應(yīng)。

大承氣湯由大黃、芒硝、枳實、厚樸組成，具有通里攻下、疏通氣機(jī)之功效。方中大黃苦寒瀉熱，祛瘀通便，蕩滌腸胃邪熱積滯，消除致病之因為君藥；然大黃苦寒，長于瀉下攻積，軟堅之力欠佳，燥屎難下，如同無水行舟，輔以芒硝咸寒瀉熱，軟堅潤燥通便為臣藥；兩者相須為用，峻下熱結(jié)之力增強(qiáng)。然積滯內(nèi)阻，致使腑氣不行，佐以厚樸苦溫下氣，除滿下脹，配以枳實苦辛破結(jié)，導(dǎo)滯消痞；兩藥行氣導(dǎo)滯，消痞除滿，助大黃、芒硝推蕩積滯，攻下通便。四藥相合，行氣瀉下并重，六腑通降，氣機(jī)暢通。

從現(xiàn)代藥理看，大黃的有效成分是蒽醌類衍生物，可促進(jìn)大腸蠕動，促進(jìn)排便[7]。芒硝主要成分為硫酸鈉，其硫酸根離子不易被腸黏膜吸收，從而存留在腸內(nèi)成為高滲性溶液，使腸內(nèi)的水分增加，促進(jìn)胃腸道蠕動。枳殼能促使胃腸收縮節(jié)律增加，緩解小腸痙攣[8]。厚樸的有效成分是厚樸酚，可緩解小腸平滑肌的痙攣，增強(qiáng)胃腸道蠕動，有利于腸功能的恢復(fù)[9]。

腸道是人體最大的細(xì)菌庫[10]。急性胰腺炎時腸功能減退，腸管脹氣，引起腹腔間隙綜合征。腸黏膜屏障破壞[11]。腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素移位，體內(nèi)免疫細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，進(jìn)而啟動全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰腺組織壞死和多臟器功能衰竭。而且由于急性胰腺炎多伴惡心、嘔吐，胃內(nèi)給藥無法起到理想效果，所以急性胰腺炎早期的胃腸道用藥途徑應(yīng)為經(jīng)過空腸給藥。

本試驗通過建立急性胰腺炎大鼠模型，觀察空腸內(nèi)注入大承氣湯對大鼠細(xì)胞因子、胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示對于急性胰腺炎大鼠模型應(yīng)用大承氣湯后，血清IL-1β、IL-18、TNF-α濃度水平均較模型組減低，胰腺組織病理學(xué)積分較模型組明顯減低，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。提示大承氣湯具有一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用和促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞因子可能是大承氣湯促進(jìn)胰腺細(xì)胞凋亡的中間環(huán)節(jié)。

[1]張素云，陳利霞.大承氣湯在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用[J].中醫(yī)中藥，2009，6（31）：70-71.

[2]Kaiser AM，Saluja AK，Sengupta A，et al.Relationship between severity，necrosis and apoptosis in five models of experimental acutepancreatitis[J].Am J Physiol，1995，269（cell physiol 380）：1295-1304.

[3]Grewal HP，Mohey DA，Gaber L，et al.Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF-alpha polyclonal antibody[J].Am J Surg，1994，167（1）：214-219.

[4]劉紹武.急慢性胰腺炎辨治[J].中醫(yī)藥研究，1990，（1）：2-3.

[5]郎潔.細(xì)胞凋亡在急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中所起作用的研究進(jìn)展[J].中國普通外科雜志，1990，17（9）：914-916.

[6]Rinderknecht H.Fatal pancreatitis，a consequence of excessive leukocyte stimulation[J].Pancreatol，1988，3（10）：105.

[7]陳德昌，楊興易，景炳文，等.大黃對危重癥患者應(yīng)激性胃腸黏膜病變的治療作用及其機(jī)制的研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1996，8（7）：395-398.

[8]黃子荷，楊德治，魏義泉，等.阿托品對枳實增強(qiáng)犬小腸電活動的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（5）：292-294.

[9]金保亮，許京峰.厚樸排氣合劑治療早期腸麻痹的臨床研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16（5）：72-73.

[10]余奎，梁曉強(qiáng)，張靜喆.術(shù)后腸麻痹中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（9）：0375-0379.

[11]馬寧，時開網(wǎng)，曹紅勇，等.強(qiáng)化胰島素治療在老年重癥急性胰腺炎患者中的臨床作用[J].實用老年醫(yī)學(xué)，2008，22（6）：449-451.