廖 剛， 王子衛(wèi)△， 張 能， 董浦江， 湯為學(xué)

(重慶醫(yī)科大學(xué)1附屬第一醫(yī)院胃腸外科，3附屬第一醫(yī)院實驗研究中心，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，重慶400016;2云南省第一人民醫(yī)院普通外科，云南昆明650032)

人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為酪氨酸蛋白激酶型受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成，與配體結(jié)合后，相互之間形成同源二聚體，也可與其它的酪氨酸激酶受體形成異源二聚體，導(dǎo)致胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶區(qū)的激活，最終引起一系列相關(guān)基因活化，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［1-3］。缺失胞內(nèi)區(qū)的EGFR為其顯性負(fù)性突變體(dominant negative EGFR，DNEGFR)，可以阻斷EGFR信號通路。腫瘤是一類細(xì)胞周期相關(guān)疾病，胃癌也不例外。針對腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，近年來一直是腫瘤生物治療的重要研究方向。DNEGFR是否對人胃癌細(xì)胞的周期有調(diào)控作用?以及具體分子機制是什么?目前未見相關(guān)報道。

材料和方法

1 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901及NCI-N87購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。pEGFP-N1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC-7901及NCI-N87細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP);pEGFPN1-DNEGFR質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC-7901及NCIN87細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)DNEGFR;均由我們前期實驗篩選成功保存［4］。

2 主要試劑、耗材及儀器

PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。無水乙醇購自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。PI購自Sigma-Aldrich。RPMI-1640培養(yǎng)基粉末、胰酶和G418購自Invitrogen。Ser9位點磷酸化糖原合成激酶3β［phosphorylated glycogen synthase kinase 3 beta at Ser9，p-GSK-3β(Ser9)］兔單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology。GAPDH(FL-335)抗體、p21(C-19)抗體、cyclin D1(A-12)抗體、周期素依賴性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)(H-298)抗體和p27(C-19)抗體購自Santa Cruz。BCA protein assay kit、Pierce ECL Western blotting substrate 和 stripping buffer購自 Thermo Fisher Scientific。RIPA裂解液(強)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF(100 mmol/L)、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和DS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所。PVDF膜購自Bio-Rad。

Forma 310系列直熱式 CO2培養(yǎng)箱為Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品。SW-CJ系列醫(yī)用型潔凈工作臺為蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和680型全自動酶標(biāo)儀為Bio-Rad產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為BD Biosciences產(chǎn)品。

3 方法

3.1 實驗分組 實驗分為如下6組:(1)SGC-7901細(xì)胞空白對照組(即SGC-7901細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，US組);(2)SGC-7901細(xì)胞pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(ES組);(3)SGC-7901細(xì)胞pEGFPN1-DNEGFR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(DS組);(4)NCI-N87細(xì)胞空白對照組(即NCI-N87細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，UN組);(5)NCI-N87細(xì)胞pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(EN組);(6)NCI-N87細(xì)胞pEGFPN1-DNEGFR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(DN組)。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 未轉(zhuǎn)染細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2及相應(yīng)濕度條件的CO2孵箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長情況，在對數(shù)生長期用0.25%的胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的 SGC-7901細(xì)胞，采用 150 mg/L G418終濃度的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng);轉(zhuǎn)染的NCIN87細(xì)胞，采用250 mg/L G418終濃度的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

3.3 細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞周期檢測根據(jù)文獻(xiàn)［5-6］操作并作一些改進(jìn)。取無菌Eppendorf管，預(yù)裝1 mL 70%乙醇，放入4℃冰箱預(yù)冷。用胰酶分別消化收獲處于對數(shù)生長期的6組單層胃癌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次。第3次洗細(xì)胞離心棄PBS時，不要完全吸棄PBS，待附在離心管壁的PBS回流到管底后，用微量移液器輕輕吹打使離心到管底的細(xì)胞成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。1 000 r/min離心5 min棄70% 乙醇，PBS洗細(xì)胞3次。加入0.5 mL PI染液重懸細(xì)胞，并放在37℃水浴中孵育30 min。設(shè)定流式細(xì)胞儀參數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。細(xì)胞周期分布采用Modifit-3軟件(Verity Software House)計算每組細(xì)胞重復(fù)實驗3次。

3.4 Western blotting檢測 Western blotting實驗方法主要根據(jù)文獻(xiàn)［7］并作以下改進(jìn)，cyclin D1和p27抗體稀釋比例為1∶100，CDK2、p21和 GAPDH抗體稀釋比例為1∶200，p-GSK-3β(Ser9)抗體稀釋比例為1∶1 200，使用Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照蛋白條帶灰度值，實驗重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，如果差異有統(tǒng)計學(xué)意義則進(jìn)一步采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較，應(yīng)用SPSS 17.0 for Windows軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞生長情況

各組人胃癌細(xì)胞生長狀態(tài)均良好，但是生長速度有一定差異。相對于US組及ES組，DS組細(xì)胞生長速度明顯要慢些。同樣，相對于UN組及EN組，DN組細(xì)胞生長速度明顯要慢些。

2 DNEGFR導(dǎo)致G0/G1期阻滯

對于SGC-7901細(xì)胞，US組及ES組G0/G1期分別為(50.03±2.01)%和(49.61±0.49)%，二者沒有顯著差異，DS組則上升到(70.88±0.85)%(P＜0.05);US組及ES組S期分別為(43.63±1.26)%和(43.63±0.64)%，二者沒有顯著差異，DS組則降低到(21.58±1.40)%(P＜0.05)。對于NCI-N87細(xì)胞，UN組及 EN組 G0/G1期分別為(47.90±2.52)%和(48.79±4.12)%，二者沒有顯著差異，DN組則上升到(69.27±4.52)%(P＜0.05);UN組及EN組S期分別為(41.77±3.08)%和(42.76±3.38)%，二者沒有顯著差異，DN組則降低到(21.88±2.40)%(P＜0.05)。另外，在DS及DN組中，流式細(xì)胞周期測定圖中G0/G1期峰前出現(xiàn)了亞二倍體峰，表明DNEGFR-EGFP還能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，見圖1。

Figure 1.Cell cycle assay of gastric cancer cells.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P ＜0.05 vs UN or EN.圖1 胃癌細(xì)胞周期分析

3 DNEGFR對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白水平的調(diào)控作用

US組及ES組SGC-7901細(xì)胞活性CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21 和 p27 蛋白水平?jīng)]有顯著差異;與US組及ES組比較，DS組CDK2、cyclin D1和 p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27蛋白水平則升高(P＜0.05)。UN組及 EN組NCI-N87 細(xì) 胞 活 性 CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21和p27蛋白水平?jīng)]有顯著差異;與UN組及EN組比較，DN組CDK2、cyclin D1和pGSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27 蛋白水平則升高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Expression of the proteins relative to cell cycle detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P＜0.05 vs UN or EN.圖2 Western blotting檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

細(xì)胞周期(cell cycle)是指一個連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂完成開始，直到下一次分裂完成為止經(jīng)歷的全過程［8］。細(xì)胞周期包括4個時相:G1期、S期、G2期和M期。G1期為DNA合成前期，主要合成RNA和蛋白質(zhì)，其是DNA復(fù)制所必需的，影響著S期的正常啟動;S期為DNA合成期;G2期為DNA合成后期，主要進(jìn)行有絲分裂中新細(xì)胞形成所必需物質(zhì)的合成，是決定細(xì)胞能否順利進(jìn)入M期(有絲分裂期)的關(guān)鍵。在哺乳動物細(xì)胞G1期存在特定的時點，Pardee［9］命名此點為限制點(restriction point)，在限制點之前如果細(xì)胞缺乏外界生長信號的持續(xù)刺激，則其會終止分裂周期進(jìn)入休眠狀態(tài)，稱為G0期。在G0期，細(xì)胞可長期存活而不分裂增殖，當(dāng)受到生長信號刺激，即可從G0期返回G1期繼續(xù)生長分裂進(jìn)程，而且即使在G1中晚期通過限制點后再除去外界生長信號的刺激，也不會阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。

細(xì)胞通過G1中晚期限制點后，細(xì)胞周期開始運行，一套嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控機制開始運作，它就是細(xì)胞周期的檢查點(check point)機制。檢查點由Weinert等［10］和 Hartwell等［11］首先發(fā)現(xiàn)并描述，實質(zhì)上是細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中發(fā)展出的一系列存活機制，作為在基因組或紡錘體損傷，或細(xì)胞周期某一事件不能按時完成情況下的一種補救措施，在G1/S交界點存在DNA損傷檢查點［12］。Cyclin D1是一重要的細(xì)胞周期調(diào)控分子［13］，不僅是調(diào)控細(xì)胞通過G1期限制點(即G0/G1期轉(zhuǎn)換)的關(guān)鍵分子之一，而且是G1/S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子，cyclin D1-CDK4/6可使pRb處于磷酸化狀態(tài)而滅活［14］，釋放出其扣留的大量轉(zhuǎn)錄因子，尤其是E2F，啟動細(xì)胞周期進(jìn)入S期所需蛋白的轉(zhuǎn)錄。另外，cyclin E-CDK2也能夠使pRb處于磷酸化狀態(tài)而滅活［15-17］。Cyclin D1-CDK4/6在 G1期早期即開始發(fā)揮作用導(dǎo)致pRb磷酸化 ，而cyclin E-CDK2直到G1晚期才開始發(fā)揮作用，cyclin D1-CDK4/6發(fā)揮作用導(dǎo)致pRb部分磷酸化是cyclin ECDK2發(fā)揮作用的基礎(chǔ)［16-17］。p21和p27是重要的CDK 抑制蛋白，p21 能夠抑制 CDK2 和 CDK4［18］，p27則能夠抑制 CDK4、CDK6 或者 CDK2［19］。

在本實驗中，人胃癌細(xì)胞被pEGFPN1-DNEGFR轉(zhuǎn)染后，將表達(dá)DNEGFR-EGFP融合蛋白，EGFP作用在于其便于對DNEGFR進(jìn)行定位，對DNEGFR功能無影響;DNEGFR降低內(nèi)源性EGFR Ser1046位點磷酸化水平，進(jìn)而降低內(nèi)源性EGFR功能，具有顯性負(fù)調(diào)控作用［20］。我們采用pEGFPN1-DNEGFR轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞，通過表達(dá)DNEGFR來阻斷人胃癌細(xì)胞EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討其對人胃癌細(xì)胞周期的影響及分子機制。

我們采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，結(jié)果提示DS及DN組胃癌細(xì)胞G0/G1期比例均升高，而S期比例均下降，表明DNEGFR能夠?qū)е挛赴┘?xì)胞G0/G1期阻滯，與采用EGFR單克隆抗體西妥昔單抗(cetuximab)在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的研究結(jié)果基本一致［21］。那么，DNEGFR能夠?qū)е挛赴┘?xì)胞G0/G1期阻滯是否與CDK2、cyclin D1、p21和p27相關(guān)呢?如果有關(guān)，具體調(diào)控機制又是什么呢?

為了明確胃癌細(xì)胞G0/G1期阻滯的分子機制，我們采用Western blotting檢測 CDK2、cyclin D1、p21、p27和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。檢測結(jié)果提示DS及DN組胃癌細(xì)胞CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低，而p21和p27蛋白水平則升高。對于GSK-3β，Ser9位點磷酸化后處于其非活性狀態(tài)［22］。據(jù)此，我們推論，pEGFPN1-DNEGFR 轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，表達(dá)出DNEGFR蛋白，DNEGFR與內(nèi)源性EGFR競爭結(jié)合EGF，導(dǎo)致EGF缺乏(EGF withdrawal)，通過降低Ser9位點磷酸化水平激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低，cyclin D1-CDK4/6含量減少;DNEGFR還使CDK2蛋白水平降低，cyclin E-CDK2含量減少;同時，DNEGFR上調(diào)p21、p27蛋白水平，抑制cyclin D1-CDK4/6及cyclin E-CDK2活性;以上三方面因素共同參與使pRb處于低磷酸化狀態(tài)，導(dǎo)致大量轉(zhuǎn)錄因子尤其是E2F被扣留，最終使胃癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)DNEGFR能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并明確了部分分子機制，將為胃癌生物治療研究提供新思路。然而，細(xì)胞周期的調(diào)控環(huán)節(jié)極為復(fù)雜，參與其中的蛋白非常多。是否有其它因素參與胃癌細(xì)胞的G0/G1期阻滯呢?這有待我們的進(jìn)一步研究來明確。

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