劉瑀曦， 王榮榮， 齊 文， 劉曉秋

(沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

蒲黃Typhae Pollen為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L．、東方香蒲 Typha orientalis Presl或同屬植物的干燥花粉。主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、浙江、江蘇和東北三省，蒲黃中含有黃酮、甾類、烷類、酸類等多種化合物［1-2］。蒲黃生用性滑，能行血消瘀;蒲黃炭用味甘澀，性微寒，有收斂之性，專止血［3-7］。

《中國(guó)藥典》2010年版 (一部)中首次明確中成藥制劑處方為飲片入藥，解決了長(zhǎng)期以來中藥飲片國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重缺乏等一系列問題，無疑將中藥飲片的質(zhì)量控制提高到一個(gè)新臺(tái)階，但大多數(shù)飲片標(biāo)準(zhǔn)還是采用藥材標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)、方法和限度進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。因此，確定對(duì)照飲片及其指紋圖譜對(duì)鑒別飲片的質(zhì)量十分必要。蒲黃炭的標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、簡(jiǎn)單的顯微鑒別和浸出物測(cè)定，不能有效控制蒲黃炭的質(zhì)量。由于蒲黃生熟異治，因此，建立蒲黃炭有別于藥材的質(zhì)量控制方法具有重要意義。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制方法，已成為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量穩(wěn)定性的重要手段。文獻(xiàn)中［8-10］報(bào)道了蒲黃的HPLC指紋圖譜，丁安偉等［11］對(duì)蒲黃及炒蒲黃的指紋圖譜研究表明蒲黃炮制前后主成分色譜峰有顯著區(qū)別。近年，通過HPLC-DAD指紋圖譜發(fā)現(xiàn)蒲黃炭與生品的黃酮類色譜峰在含有量上有較大變化外，炒炭后有極性較大的新色譜峰生成，而且此部分還具有止血作用［12］。而應(yīng)用HPLC特征指紋圖譜鑒別蒲黃炭未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用一種快速、簡(jiǎn)單的方法，建立10批不同地區(qū)蒲黃及蒲黃炭的指紋圖譜，為蒲黃炭對(duì)照指紋圖譜的建立及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 DT-100型分析天平 (北京光學(xué)儀器廠);Simadzu高效液相色譜儀 (LC-10Atvp泵，DAD檢測(cè)器，Class-vp工作站;日本島津公司);C3860A型超聲清洗器 (天津開發(fā)區(qū)色譜分析儀器有限公司);微量進(jìn)樣器 (美國(guó)HAMILTON公司)。

1.2 試劑 乙腈 (色譜醇，天津市康科德科技有限公司);娃哈哈飲用純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);其它試劑均為分析純。

1.3 試藥 香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和異鼠李素對(duì)照品(自制，純度﹥95%)，蒲黃藥材10批 (見表1)，由沈陽藥科大學(xué)劉曉秋教授鑒定為香蒲科香蒲屬植物的花粉。

表1 蒲黃藥材來源Tab.1 Sources of samples of Typhae Pollen

2 方法與結(jié)果

2.1 供試溶液的制備

2.1.1 蒲黃炭品的制備 取本品約100 g，按照《中國(guó)藥典》2010年版 (一部)附錄ⅡD炒炭法進(jìn)行炮制，武火炒至樣品表面為棕黃色，即得蒲黃炭品 (炒炭后減重約8%)。

2.1.2 生、炭供試品溶液的制備 分別取生品、炭品粉末約0.4 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚及異鼠李素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 36.2、71.5、16.1、20.4、6.4、9.3 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (5μm，250×4.6 mm，美國(guó)安捷倫科技公司);流動(dòng)相為乙腈 (A)－0.05%磷酸溶液 (B)，梯度洗脫，0～15 min(95%-85%B)，15～20 min(85%-83%B)，20～35 min(83% ～80%B)，35～45 min(80% ～76%B)，45～50 min(76% ～60%B)，50～65 min(60% ～60%B)，65～70 min(60% ～95%B);體積流量0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量20μL。

2.3 炮制工藝重復(fù)性考察 分別精密稱取蒲黃生品5份 (B3)，按2.1.1項(xiàng)平行制備蒲黃炭品，按2.1.2項(xiàng)平行制備蒲黃炭供試品溶液，分別進(jìn)樣并記錄，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.4%～1.1%，相對(duì)峰面積的RSD為0.7%～4.5%，表明炮制工藝較穩(wěn)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液 (B3)，連續(xù)進(jìn)樣5次，以9號(hào)峰為內(nèi)參比峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～0.4%，相對(duì)峰面積的RSD為1.1%～2.8%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取樣品5份(B3)，按2.1.2項(xiàng)平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣并記錄。測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～0.4%，相對(duì)峰面積的RSD為0.7%～2.8%。符合指紋圖譜要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 (B3)，分別于制備后0、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.2%～1.5%，相對(duì)峰面積的RSD為1.1%～2.8%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的分析與評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立及部分色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)2.2項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)10批不同地區(qū)的蒲黃藥材及蒲黃炭品進(jìn)行了測(cè)定，采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件，分別對(duì)生品和炭品進(jìn)行色譜峰匹配，見圖1;分別生成蒲黃生品、炭品共有模式的對(duì)照指紋圖譜，見圖2。

對(duì)照品混合溶液20μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，見圖3。通過比較各色譜峰的保留時(shí)間，確定指紋圖譜中香蒲新苷 (9號(hào)峰)、異鼠李素3-O-新橙皮糖苷 (11號(hào)峰)、槲皮素 (15號(hào)峰)、柚皮素 (16號(hào)峰)，山柰酚 (17號(hào)峰)、異鼠李素 (18號(hào)峰)的位置。其中9號(hào)峰與其他峰分離效果好，在色譜圖中保留時(shí)間居中，故作為參比峰。

圖1 10批蒲黃 (A)和蒲黃炭 (B)指紋圖譜Fig.1 The finger p rints of Tyhae Pollen(A)and Typhae Pollen Carbonisata(B)from 10 batches

圖2 蒲黃 (C)和蒲黃炭 (D)對(duì)照指紋圖譜Fig.2 The reference fingerprints of Tyhae Pollen(C)and Typhae Pollen Carbonisata(D)

圖3 對(duì)照品的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances

2.5.2 生、炭品指紋圖譜相似度分析及色譜峰變化情況 以共有模式為參照，通過國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》計(jì)算，得到各批次藥材色譜指紋圖譜相似度結(jié)果見表2。生品、炭品對(duì)照指紋圖譜保留時(shí)間、峰面積及變化率見表3。

由表2可以看出，蒲黃生品相似度除9號(hào)樣品為0.865，其余在0.938～0.989。蒲黃炭品相似度在0.820～0.919之間，表明蒲黃生品的相似度比蒲黃炭品的相似度高，推測(cè)蒲黃炒炭后各類成分含有量變化可能與不同產(chǎn)地和品種有關(guān)。

通過表3并結(jié)合圖2和圖3表明，生蒲黃共有峰為15個(gè)，炭品18個(gè)。通過對(duì)蒲黃生、炭品的峰面積進(jìn)行比較，炒炭后，保留時(shí)間在20 min前，有3個(gè)新增色譜峰，見圖2(a)(峰1～3);保留時(shí)間在20～30 min時(shí)，色譜峰面積略有增加，見圖2(b)(峰4～5);保留時(shí)間在30～50 min時(shí)，除14號(hào)峰外，黃酮苷所在部位色譜峰面積均呈明顯下降勢(shì)，見圖2(c)(峰6～13);保留時(shí)間在50～70 min時(shí)，柚皮素及山柰酚略有下降，槲皮素和異鼠李素有所增加，見圖2(d)。這充分說明了蒲黃經(jīng)炒炭后，其化學(xué)成分發(fā)生了質(zhì)和量的變化。

表2 蒲黃和蒲黃炭相似度比較Tab.2 Com parison of sim ilarities of Typhae Pollen and Typhae Pollen Carbonisata

表3 蒲黃和蒲黃炭峰面積及變化率Tab.3 The peak area and change rate of Typhae Pollen and Typhae Pollen Carbom isata(n=10)

2.6 指紋圖譜鑒別蒲黃炭的質(zhì)量 炒炭的溫度和火候?qū)ζ腰S炭的質(zhì)量至關(guān)重要，蒲黃炒炭過火，其原有成分幾乎消失殆盡，而新增成分的量也會(huì)明顯減少，見圖4。因此可用指紋圖譜鑒別蒲黃炭的質(zhì)量。

圖4 炒過火的蒲黃炭HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of Typhae Pollen Carbonisata fried excessively

3 討論

3.1 應(yīng)用HPLC-DAD檢測(cè)，通過對(duì)各成分紫外吸收?qǐng)D譜的分析，綜合考慮基線、色譜峰的數(shù)目、峰形及信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，確定254 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 本研究選取10批不同產(chǎn)地的蒲黃藥材，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版 (一部)蒲黃質(zhì)量進(jìn)行檢定，均為合格品。蒲黃炭品與蒲黃生品比較，各類成分含有量波動(dòng)稍大，但相似度均大于0.8，這可能與藥材的來源、品質(zhì)及炮制過程中各類成分之間的相互作用有關(guān)。炒炭炮制的火候的掌握也非常重要，提示應(yīng)注意炮制規(guī)范，有關(guān)蒲黃炮制機(jī)理及蒲黃炮制火候與外觀顏色及質(zhì)量的關(guān)系目前本研究組正在研究。

3.3 本實(shí)驗(yàn)建立的蒲黃炭的特征指紋圖譜實(shí)際上隱含著其藥效的指標(biāo)，各種類別成分的色譜峰面積(峰高)的比值與藥效的相關(guān)性是保證炮制品質(zhì)量的重要參數(shù)，需要進(jìn)一步累計(jì)多批數(shù)據(jù)加以確定。本方法快速、簡(jiǎn)單易行，與以單一化學(xué)對(duì)照品作為指標(biāo)性成分的方法相比，能夠較全面地反映蒲黃炭的質(zhì)量。

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