簡龍海， 聞宏亮， 毛秀紅， 夏 晶， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

痰熱清注射液具清熱、化痰、解毒之功效，處方由黃芩、熊膽粉等五味藥材組成。其中熊膽粉為熊科動物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品［1］，主要成分為膽汁酸，并主要以?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸等結(jié)合型形式存在［2-3］。在制法中，熊膽粉先經(jīng)過水解、提取等步驟，制得中間體熊膽粉提取物后再制備注射液。理論上，痰熱清注射液中的膽汁酸應以游離型膽汁酸為主。游離型膽汁酸有的活性強、毒性小，如熊去氧膽酸［4］，有的活性與毒性并存，如鵝去氧膽酸［5］，因此需要嚴格控制膽汁酸的量。目前痰熱清注射液中膽汁酸的測定集中在熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸上［6-7］，未見其余膽汁酸的測定報道。

關(guān)于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的測定方法，有HPLC-ELSD 法［6-8］、HPLC-UV 法［9-10］、GC 法［11］、TLC法［12］、近紅外漫反射光譜法［13］等。GC 法需要先衍生反應后再分析。痰熱清注射液成分復雜，TLC法和近紅外漫反射光譜法均不能滿足測定要求。HPLC-ELSD法雖可測定熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸［6-7］，但由于熊去氧膽酸的含有量較高，其余膽汁酸的含有量較低，若同時測定指紋圖譜，熊去氧膽酸的信號過強，呈平頭峰形，故定量測定與指紋圖譜在HPLC-ELSD上難以同時兼顧。HPLC-UV法在一定條件下可用于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測定［9］及熊膽粉的指紋圖譜分析［10］，但尚未應用于痰熱清注射液的測定。

本實驗建立了HPLC-UV法同時測定痰熱清注射液中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，并在此基礎(chǔ)上，測定痰熱清注射液中熊膽粉部分所有主要膽汁酸的指紋圖譜，方法簡便、可行，可為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司);Waters 1525型高效液相色譜儀 (美國Waters公司);BP211D電子天平 (德國Sartorius公司)。

1.2 試藥 熊去氧膽酸 (中國藥品生物制品檢定所提供，批號0755-9003);鵝去氧膽酸 (中國藥品生物制品檢定所提供，批號110806-200303);乙腈、甲醇 (均為色譜純，德國Merck公司);水為純凈水;其余試劑均為分析純 ［中國醫(yī)藥 (集團)上?；瘜W試劑公司］。痰熱清注射液及熊膽粉提取物由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取熊去氧膽酸對照品和鵝去氧膽酸對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1 mL中含熊去氧膽酸5.0 mg、鵝去氧膽酸0.8 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2 痰熱清注射液供試品溶液的制備 取痰熱清注射液作為供試品溶液A。

2.3 熊膽粉提取物供試品溶液的制備 取熊膽粉0.15 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液B。

2.4 空白溶液 (缺熊膽粉)的制備 取空白樣品(缺熊膽粉)，按痰熱清注射液質(zhì)量標準中的處方量和制法項下要求制成空白溶液。

2.5 色譜條件 Waters Atlantis C18(4.6 mm×15cm，5μm)色譜柱;乙腈為流動相A相，0.1%磷酸為B相，梯度洗脫程序見表1;柱溫30℃;體積流量為1 mL/min;檢測波長為203 nm;進樣20μL。對照品、空白 (缺熊膽粉)及供試品色譜圖見圖1～4。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

圖1 對照品圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

圖2 空白樣品 (缺熊膽粉)Fig.2 HPLC chromatogram of sample w ithout bear bile powder

2.6 指紋圖譜

2.6.1 指紋圖譜方法學考察

2.6.1.1 相似度計算中共有峰的確立 根據(jù)痰熱

圖3 痰熱清注射液樣品Fig.3 HPLC chrom atogram of Tanreqing Injection sam ple

圖4 熊膽粉提取物Fig.4 HPLC chromatogram of bear bile powder sam ple

清注射液成品、中間體熊膽粉提取物及空白溶液(缺熊膽粉)的測定結(jié)果，痰熱清注射液成品中與熊膽粉有關(guān)的共有峰主要有4個 (見圖1～4)，其中峰1(熊去氧膽酸)面積在4個峰總面積中的比例較高 (約為75% ～80%)，對相似度計算結(jié)果的影響過大，故在相似度計算中對峰1進行屏蔽。

2.6.1.2 精密度試驗 取供試品溶液A，連續(xù)測定6次，結(jié)果峰1～峰4的峰面積RSD分別為1.3%、4.8%、2.0%、5.9%。以熊去氧膽酸為參照物，計算峰2～峰4的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時間RSD≤0.2%，相對峰面積RSD≤5.4%。以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結(jié)果相似度≥0.99，表明儀器精密度良好。

2.6.1.3 重復性試驗 取供試品溶液A，一式6份，依法測定，同2.6.2方法計算相對保留時間、相對峰面積和相似度，結(jié)果相對保留時間RSD≤0.2%，相對峰面積RSD≤4.7%，相似度≥0.99，

表明方法重復性良好。

2.6.1.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液A，分別在室溫放置0、6、12、18、24 h后測定，結(jié)果峰1～峰4的峰面積RSD分別為0.5%、3.5%、0.5%、3.0%。同2.6.1.2項方法計算相對保留時間、相對峰面積和相似度，結(jié)果相對保留時間均RSD≤0.2%，相對峰面積均 RSD≤3.8%，相似度≥0.99，表明供試品溶液A在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.2 痰熱清注射液中熊膽粉部分對照指紋圖譜的建立及13批成品的測定 取13批成品進行測定，通過相似度軟件獲得對照指紋圖譜，結(jié)果見圖5、表 2。13批成品的相似度分別為 0.998、0.997、 0.999、 0.989、 0.999、 0.998、 0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.989。

圖5 痰熱清注射液熊膽粉部分13批次樣品HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of 13 batches of Tanreqing Injection sample

表2 指紋圖譜中共有峰相對保留時間及峰面積Tab.2 Relative retention time and relative peak area of co-possessing peaks and their RSDs

2.7 樣品測定

2.7.1 線性關(guān)系考察 分別取熊去氧膽酸對照品和鵝去氧膽酸對照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解并制成每1 mL中含熊去氧膽酸 13.064 mg、17.14 mg的對照品溶液和每1 mL中含鵝去氧膽酸5.21 mg的對照品溶液。分別精密吸取質(zhì)量濃度為13.064 mg/mL的熊去氧膽酸對照品溶液0.5、1、2、5、10、20μL，質(zhì)量濃度為17.14 mg/mL的熊去氧膽酸對照品溶液40μL，質(zhì)量濃度為5.21 mg/mL的鵝去氧膽酸對照品溶液0.5、1、2、5、10、40μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得熊去氧膽酸回歸方程Y=8.688X+8.141(r=0.999 9)，鵝去氧膽酸回歸方程 Y=8.213X+1.139(r=0.999 9)。結(jié)果表明:熊去氧膽酸進樣量在6.532μg～685.6μg范圍內(nèi)、鵝去氧膽酸進樣量在2.605μg～208.4μg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.7.2 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗 分別同2.6.1.2、2.6.1.4。

2.7.3 重復性試驗 取供試品溶液A 6份，測定，計算，結(jié)果熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸RSD分別為1.1%、1.5%，表明該方法重復性良好。

2.7.4 回收率試驗 取供試品溶液A 9份，每份0.8 mL(分別含熊去氧膽酸4.896 mg、鵝去氧膽酸0.672 mg)，分別置2 mL量瓶中，各精密加入熊去氧膽酸對照品溶液 (質(zhì)量濃度為13.064 mg/mL)0.3、0.4、0.5 mL和鵝去氧膽酸對照品溶液 (質(zhì)量濃度為5.21 mg/mL)0.1、0.2、0.3 mL，加甲醇至刻度，搖勻，測定，計算加樣回收率及其RSD，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests(n=9)

2.7.5 樣品測定 取13批痰熱清注射液成品，測定，結(jié)果見表4。

表4 痰熱清注射液樣品中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸測定結(jié)果Tab.4 Results of ursodesoxycholic acid and chenodeoxycholic acid in Tanreqing Injection

3 討論

3.1 指紋圖譜中各峰的確認 將流動相中磷酸改為甲酸，其余不變，采用LC-DAD-MSn聯(lián)用儀，對4個共有峰進行確認，結(jié)果峰1、峰3分別為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸，峰2、峰4均為膽汁酸，具體結(jié)構(gòu)式將進一步研究。

3.2 色譜柱的考察 分別取3種色譜柱 ［Waters Atlantis dC18色譜柱 (5μm，4.6 mm×15 cm);Dikma Kromasil C18色譜柱 (5μm，4.6 mm×15 cm);Dikma Kromasil C18色譜柱 (5μm，4.6 mm×25 cm)］進行分析，結(jié)果均無干擾。

3.3 柱溫和體積流量的考察 分別在柱溫25、30、40℃和體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min時進樣測定，結(jié)果柱溫和體積流量的變化對分離度、峰形均無明顯影響;柱溫的變化對峰面積和保留時間的影響不大;體積流量對峰面積的影響較大，體積流量越大，峰面積越小，但對指紋圖譜、定量測定結(jié)果均無明顯影響。

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