孫雪菲，司沛沛，楊小榮，張 策

HuR是RNA結(jié)合蛋白（RNA－binding proteins，RBPs）中果蠅胚胎致死異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族的一員，它通過和細(xì)胞內(nèi)mRNA非翻譯區(qū)富含Au元件（ARE）的結(jié)合，保持mRNA的穩(wěn)定性，使之不易被降解而增強(qiáng)其表達(dá)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用。HuR蛋白作為ELAV家族中唯一一種廣泛表達(dá)的蛋白，能在多種細(xì)胞系中表達(dá)，并參與生物發(fā)育的正常生命活動過程。

SH－SY5Y細(xì)胞是1970年建自骨瘤轉(zhuǎn)移灶的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK－N－SH細(xì)胞系經(jīng)三次克隆后的亞系（SK－N－SH→SH－SY→SHSY5→SH－SY5Y）。該細(xì)胞繁殖快，細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制方面的研究。

本實(shí)驗(yàn)擬通過RNA干擾技術(shù)，探討HuR基因沉默后對SH－SY5Y細(xì)胞活力的影響，初步闡明HuR蛋白在SH－SY5Y細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體 細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM、F12、增強(qiáng)型考馬斯蛋白定量試劑盒購自博士德，澳洲血清（FBS）購自Gibico公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti－MEM無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。兔抗人HuR抗體購自Abcam公司。細(xì)胞裂解液購自武漢碧云天生物科技有限公司。cck－8試劑盒購于Dojindo公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。β－actin山羊抗兔二抗購自中杉金橋；Super ECL Plus超敏發(fā)光液購自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SH－SY5Y細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫，用含有10%FBS、100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素的DMEM和F12培養(yǎng)基，將細(xì)胞以1×105的濃度接種于孔板或培養(yǎng)瓶中，在37℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 HuR干擾質(zhì)粒（5′－AAGGACGTAGAAGACATGT－3′）由廣州復(fù)能基因構(gòu)建。轉(zhuǎn)染時(shí)按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000與質(zhì)粒比例為1∶2.5轉(zhuǎn)染。

1.4 Western blot檢測與分析 HuR干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h裂解細(xì)胞收集蛋白，蛋白定量用增強(qiáng)型考馬斯亮藍(lán)蛋白定量（博士德）。10%的SDS－PAGE電泳（80V，20min；120V，90min）后，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，TBST洗膜三次，每次5min。0.3%明膠室溫封閉1h。加入 HuR（1∶3 000）、β－actin（1∶3 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后孵二抗（1∶3 000），室溫孵育1.5h。洗膜后膜上鋪ECL超敏發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)成像，并加以分析。

1.5 CCK－8（Cell counting Kit－8）的測定 96孔板中的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24h后，每孔加入CCK－8 10μL，37℃避光培養(yǎng)2h，上酶標(biāo)儀測定，檢測波長450nm，參比波長650nm。

1.6 LDH釋放的檢測 六孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后 ，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照說明書進(jìn)行LDH活性的檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 HuR表達(dá)水平的檢測 Western Blot檢測結(jié)果顯示：與正常組相比，干擾組HuR蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，其蛋白抑制率為77.05 %（P＜0.05）；而空質(zhì)粒組、lipo2000組的HuR蛋白水平與對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1。

圖1 HuR蛋白表達(dá)水平的檢測

2.2 CCK－8檢測 HuR干擾組的細(xì)胞活力下降，約為對照組的52.28%（P＜0.05）；與對照組相比，lipo2000組和空質(zhì)粒組的細(xì)胞活力均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖2。

圖2 細(xì)胞活力觀察

2.3 LDH釋放的檢測 與對照組相比，HuR干擾組的LDH水平增高約83.37%（P＜0.05），lipo2000組和空質(zhì)粒組對LDH的釋放無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖3。

圖3 LDH釋放觀察

3 討 論

HuR可通過一定的信號途徑以及剪接、磷酸化、乙?；榷喾N修飾參與細(xì)胞增殖、分化等多種行為的調(diào)節(jié)[1，2]，并在神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞分化中具有重要作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)[4－14]，HuR在PI3K／AKT／NF－κB、p38／MAPK 等細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中或應(yīng)激、低氧條件啟動下可以穿過細(xì)胞核到達(dá)細(xì)胞漿，通過和細(xì)胞內(nèi)mRNA非翻譯區(qū)富含Au元件（ARE）的結(jié)合，保持mRNA的穩(wěn)定性，使之不易被降解，而加強(qiáng)靶因子的翻譯表達(dá)。目前認(rèn)為HuR在許多生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。例如，Lal等發(fā)現(xiàn)HuR可通過增強(qiáng)多種抗凋亡蛋白（如凋亡抑制體前胸腺素α）的表達(dá)，在細(xì)胞早期的應(yīng)激反應(yīng)中具有抗凋亡作用[15]；HuR可上調(diào)上皮細(xì)胞生長因子及粒細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；HuR通過調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，使環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖而發(fā)揮其致癌作用[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)將HuR基因沉默后，細(xì)胞活力下降，表明HuR蛋白在SH－SY5Y細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HuR沉默后，炎癥因子 mRNA轉(zhuǎn)錄明顯減少[17]。Abdelmohsen等[18]發(fā)現(xiàn)在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中HuR磷酸化增加導(dǎo)致HuR與SIRT1mRNA結(jié)合減少，SIRT1mRNA的穩(wěn)定性下降，SIRT1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞損傷增多。因此推測，將HuR基因在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y中沉默后，導(dǎo)致某一與細(xì)胞存活相關(guān)的靶蛋白mRNA的穩(wěn)定性下降，靶蛋白表達(dá)減少，從而引起細(xì)胞活力下降，細(xì)胞損傷。但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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