梁俊紅，曹錫梅，萬東方，張 潮，郭大瑋

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，引起AS的病因很復(fù)雜。巨噬細(xì)胞在其發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用[1，2]。抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有可能成為預(yù)防和治療AS的一個(gè)重要的方向。已知人單核白血病（THP－1）細(xì)胞具有單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能和生理學(xué)特性，被廣泛用于毒理學(xué)、免疫學(xué)和動(dòng)脈粥樣硬化等研究領(lǐng)域[3]。而G－細(xì)菌細(xì)胞膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)生免疫反應(yīng)[4]。明確LPS刺激THP－1細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平將有助于揭示AS的病因。

實(shí)時(shí)定量PCR（RT－qPCR）較普通PCR定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，已經(jīng)成為分析基因轉(zhuǎn)錄水平的首選方法[5－7]。然而，多種變量因素影響其數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析，如提取RNA的質(zhì)量、酶的效率（反轉(zhuǎn)錄效率，擴(kuò)增效率）等等。為了去除這些變量可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，實(shí)驗(yàn)者通常選擇表達(dá)穩(wěn)定的單一內(nèi)參基因GAPDH或ACTB進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。然而越來越多的研究表明，某些條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因變得不再穩(wěn)定[8，9]。為了確保RT－qPCR結(jié)果的可靠性，Bustin等[10]針對(duì)實(shí)驗(yàn)中的種種問題提出一套標(biāo)準(zhǔn)指南（MIQE指南）。本研究依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)指南共選取10個(gè)候選看家基因：ACTB、GAPDH、RPL37A、PPIB、PGK1、PPIA、SDHA、TBP、HPRT1、RPL13A ，通過 SYBR－Green RT－qPCR技術(shù)對(duì)LPS刺激THP－1細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估不同條件下適合此細(xì)胞基因表達(dá)水平研究的內(nèi)參基因，以確保后期RT－qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 THP－1細(xì)胞培養(yǎng)與樣本采集 THP－1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（TCHu－57），用含10%FBS（Gibco 10099－141，購(gòu)自北京茂建）的 RPMI－1640（Hyclone，SH30809.01B）培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。穩(wěn)定培養(yǎng)傳2代～3代后給予Lipopolysaccharide（LPS，Sigma，L2880，10μg／mL）刺激。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)LPS刺激 THP－1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)：LPS刺激0h、2h、6h、12h、24h。

1.2 總RNA提取純化與反轉(zhuǎn)錄 依照說明書使用TransZol Up（ET111－01，北京全式金生物技術(shù)有限公司）抽提上述5個(gè)時(shí)間點(diǎn)THP－1細(xì)胞的總RNA，DNaseI（D2215，TaKaRa大連寶生物工程有限公司）去除基因組DNA的污染，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣本RNA的濃度與純度。參照反轉(zhuǎn)錄PrimeScriptTM－reagent kit（DRR037S，TaKaRa大連寶生物工程有限公司）說明書，以400ng總RNA為模板合成cDNA，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)中涉及的所有內(nèi)參基因的基因序列均來自于GenBank。采用Allele ID6對(duì)序列進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)適合于SYBR Green的特異性上、下游引物（見表1），委托上海英駿公司（Invitrogen）合成。RT－qPCR反應(yīng)總體系為20μL，包括2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL、ROX 0.2μL、10 μmol／L上下游引物各0.4μL、cDNA模板1μL、ddH2O補(bǔ)齊余體積。Stratagene實(shí)時(shí)熒光定量?jī)xMx3000p運(yùn)行，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5s、95℃變性5s、55℃退火30s、72℃延伸30 s并收集熒光，40個(gè)循環(huán)，57℃～95℃生成熔解曲線。每個(gè)樣品3次重復(fù)。經(jīng)過Mx3000p軟件分析，可以得到各內(nèi)參基因的循環(huán)閾值（Ct）。

表1 RT－qPCR中所用候選看家基因引物

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增效率的驗(yàn)證 以cDNA第一鏈為模板，做梯度稀釋。依次做5個(gè)梯度稀釋后cDNA初始濃度分別為1／10、1／102、1／103、1／104、1／105。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次，通過RT－qPCR分析相關(guān)系數(shù)，擴(kuò)增效率等通過Stratagene實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Mx3000P自帶軟件得到。

1.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)qRT－PCR定量分析結(jié)果，利用GeNorm和NormFinder軟件對(duì)各候選內(nèi)參基因在LPS刺激不同時(shí)間后的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而篩選出最優(yōu)的內(nèi)參基因。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)參基因引物特異性 普通PCR擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)每個(gè)內(nèi)參基因引物的特異性，結(jié)果如圖1所示，各引物條帶清晰，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小正確。各內(nèi)參基因的溶解曲線均為單一峰，證明內(nèi)參基因引物特異性良好。

圖1 10個(gè)候選內(nèi)參基因1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 熒光定量PCR的效率（見表2） 10個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值變化范圍為0.990～0.999，表明cDNA初始模板量與其相應(yīng)的Ct值線性關(guān)系較好。

表2 10個(gè)候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、相關(guān)系數(shù)及PCR擴(kuò)增效率

2.3 NormFinder軟件分析 5個(gè)樣本經(jīng)10個(gè)候選基因的特異性引物擴(kuò)增后，Ct值分布如圖2所示，由圖可知GAPDH、PGK1Ct值比較穩(wěn)定。

經(jīng)GenEx軟件中Normfinder分析，10個(gè)候選內(nèi)參基因的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差如圖3所示，經(jīng)過分析，Normfinder選擇GAPDH（SD＝0.0951）為最佳基因，說明在分析LPS刺激后THP－1細(xì)胞mRNA的表達(dá)量時(shí)GAPDH的變化最小，而RPL13A（SD＝1.539 4）最不穩(wěn)定。

圖2 候選內(nèi)參基因經(jīng)Normfinder分析后穩(wěn)定性排列

2.4 GeNorm軟件分析結(jié)果 Genorm軟件通過分析內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性（M）來確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，但該程序基于標(biāo)準(zhǔn)差，默認(rèn)M＝0.5為取舍值。若某內(nèi)參基因的M值小于0.5，可考慮將其作為內(nèi)參基因。M值越大表示其穩(wěn)定性越差；反之，穩(wěn)定性越好。由圖3可知，候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性為GAPHD＝PGK1＞PPIB＞RPL37A＞HPRT1＞ACTB＞PPIA＞SDHA＞TBP＞RPL13A。GAPDH、PGK1穩(wěn)定性好，適合作為L(zhǎng)PS刺激下THP－1細(xì)胞基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。

表3 GeNorm軟件分析候選內(nèi)參基因在LPS刺激THP－1不同時(shí)間后的表達(dá)穩(wěn)定性

3 討 論

RT－PCR是分析基因轉(zhuǎn)錄水平的首選方法，為了確保其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，選擇合適的內(nèi)參基因是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。內(nèi)參基因通常是各種看家基因，在細(xì)胞內(nèi)組成性表達(dá)，有助于保持細(xì)胞的功能。由于內(nèi)外環(huán)境的變化，在細(xì)胞內(nèi)真正恒定表達(dá)的基因并不存在。RT－PCR實(shí)驗(yàn)中選擇的理想內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：①不存在假基因，避免基因組DNA的擴(kuò)增；②表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)；③穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；④高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)；⑤其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；⑥不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。實(shí)際上能滿足這些條件的基因幾乎是不存在的，目前所研究的基因（包括看家基因）在不同類型的細(xì)胞、組織及實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)均有差異[11]，研究者有必要針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)條件、分析尋找適合各自實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的特異性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

本研究依據(jù)MIQE指南共選取10個(gè)候選看家基因，采用NormFinder和GeNorm軟件評(píng)估不同條件下適合THP－1細(xì)胞基因表達(dá)水平研究的內(nèi)參基因。NormFinder軟件經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線或ΔCt法將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成線性表達(dá)量，然后通過方差分析得出基因的表達(dá)穩(wěn)定值 M，可以直接評(píng)價(jià)基因的穩(wěn)定性[12]。GeNorm軟件是通過分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值來篩選內(nèi)參基因[13]。原始數(shù)據(jù)先經(jīng) 2– ΔCt（EMinCt－SampleCt）法轉(zhuǎn)換成相對(duì)表達(dá)量輸入Excel表格，GeNorm軟件將每個(gè)候選內(nèi)參基因與其他候選基因的配對(duì)表達(dá)水平比值進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定值M，然后對(duì)所有候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排序。根據(jù)NormFinder和GeNorm軟件分析得出本實(shí)驗(yàn)中GAPDH和PGK1是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。RT－PCR進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄分析中選擇一個(gè)以上的內(nèi)參基因作內(nèi)參可以得到更可靠的結(jié)果[14]，為確保后期RT－qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，同時(shí)選用GAPDH和PGK1校正目的基因表達(dá)。

總之，RT－PCR實(shí)驗(yàn)中研究者應(yīng)該根據(jù)細(xì)胞和組織的類型及不同實(shí)驗(yàn)條件，選擇最合適的內(nèi)參基因，選擇2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因?qū)⒂兄诘玫礁煽康慕Y(jié)果。

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