劉明剛，朱 權(quán)，孫美珍，孫 洋，李 偉

外傷性癲癇（post－traumatic epilepsy）是指腦組織從腦外傷開始，經(jīng)過一定的潛伏期，產(chǎn)生了慢性、復(fù)發(fā)性、自發(fā)性癲癇發(fā)作的過程，外傷性癲癇是最適合研究人類癲癇發(fā)生機(jī)制的模型[1]。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，50%以上病人由各種腦損害引起，即癥狀性癲癇，而腦外傷后發(fā)生癲癇的危險(xiǎn)性比正常人高3倍以上，其發(fā)生率為4%～53%，占癥狀性癲癇的首位[2]。外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，最近的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明血－腦屏障（BBB）的破壞在外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過自由落體損傷模型分析外傷性大鼠血腦屏障破壞程度與癲癇發(fā)作的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雌雄性各半SD大鼠62只，體重200g～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，給予適宜溫度（23℃～25℃）和24h光照／暗周期，允許自由飲食。將其隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組10只，不給損傷處理；甘露醇應(yīng)用組26只，給予頭部損傷處理，在頭部損傷后24h內(nèi)，用25%甘露醇注射液1.5g／kg尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3d，以提高血腦屏障的滲透性；模型對(duì)照組26只，給予頭部損傷處理，用等體積生理鹽水尾靜脈注射，在頭部損傷后24h內(nèi)應(yīng)用，每天應(yīng)用1次，連續(xù)用3d?？瞻讓?duì)照組再分為兩組分別飼養(yǎng)3d和3個(gè)月，每組5只；甘露醇應(yīng)用組和模型對(duì)照組再分別各分為3組，飼養(yǎng)3d和7d各8只，飼養(yǎng)3個(gè)月各10只。

1.2 動(dòng)物模型的制備 將SD大鼠用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頂部去毛，消毒，沿正中線切開頭皮暴露顱骨，長(zhǎng)度約1.5cm，在矢狀縫右側(cè)，據(jù)前囟0.15cm，矢狀縫0.25cm處為中心開骨窗，直徑為0.4cm，但不損傷硬膜，然后將大鼠連到自由落體打擊裝置上，釋放重錘，根據(jù)吳旭等[4]研究制作成重型顱腦損傷模型。打擊后切口內(nèi)注入40 000U慶大霉素注射液0.5mL預(yù)防感染，縫合頭皮?？瞻讓?duì)照組僅開顱窗不施加打擊。

1.3 方法

1.3.1 BBB通透性測(cè)定 飼養(yǎng)3d和7d的大鼠用于血腦屏障通透性的測(cè)定。伊文氏藍(lán)（EB）的滲出量與血腦屏障的開放程度成正相關(guān)，應(yīng)用分光光度計(jì)在EB最大吸收光譜635nm處檢測(cè)腦組織中的EB含量，可以作為判斷血腦屏障開放程度的一種定量指標(biāo)，其腦組織EB含量亦代表血清白蛋白的滲出量[5]7μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL、6μg／mL、8 μg／mL、10μg／mL為EB標(biāo)準(zhǔn)濃度，繪制伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 行為學(xué)觀察 飼養(yǎng)3個(gè)月的大鼠用于行為學(xué)觀察。采用人工觀察和視屏監(jiān)測(cè)大鼠24h活動(dòng)，按Racine’s分級(jí)（0級(jí)，無驚厥；1級(jí)，閉眼、胡須動(dòng)，口、鼻、面肌陣攣；2級(jí)，在1級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭；3級(jí)，在2級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣；4級(jí)，在3級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立；5級(jí)，在4級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)跌倒發(fā)作）記錄大鼠癲癇發(fā)作情況。

1.3.3 腦電圖采集 模型建立后觀察發(fā)現(xiàn)有類似癲癇發(fā)作2次以上的大鼠進(jìn)行腦電圖信息采集，將大鼠用20%烏拉坦注射液（5mL／kg）麻醉，固定于腦立體定位儀上，用電生理信號(hào)采集儀描記大鼠皮層腦電活動(dòng)，當(dāng)出現(xiàn)重復(fù)暴發(fā)性棘波、棘慢復(fù)合波或尖波等癲癇樣放電波幅超過基線的兩倍并持續(xù)5s以上時(shí)確定為EEG發(fā)作。

1.3.4 標(biāo)本制作 10%水合氯醛注射液3mL／kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于解剖板上，劍突下開胸，從心尖部將穿刺針向主動(dòng)脈方向插入，剪開右心耳，用300mL生理鹽水灌注沖洗，接著用4%的多聚甲醛200mL～300mL灌注，在整個(gè)灌注過程中可以觀察到大鼠全身肌肉顫動(dòng)，而后逐漸僵硬、強(qiáng)直，再將腦組織完整取出，浸泡于4%多聚甲醛中后固定，4℃冰箱保存，1周內(nèi)切片。每塊厚約2mm，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋后作連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，每隔2張取1張切片，每例標(biāo)本取切片不少于8張。

1.3.5 免疫組化染色（SABC法） 切片常規(guī)脫蠟至水，用0.3%H2O2室溫處理5min～10min以滅活內(nèi)源性酶，入0.01 mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中微波抗原修復(fù)10min，再次PBS漂洗后入5%BSA封閉液，室溫20min，后按ABC法行抗GFAP免疫組織化學(xué)反應(yīng)。依次孵育于兔抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體稀釋液（1∶200），37℃1h；生物素化山羊抗兔IgG（1∶150）37℃20min；SABC（1∶150）37℃20min。以上每一步驟之后均用0.01mol／L PBS（pH7.2～7.6）漂洗5min×3次。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明和封片，顯微鏡觀察。以上試劑均購于博士德生物試劑公司。

1.3.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù) GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平可代表星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況[6]7倍光鏡下對(duì)海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每只鼠各取三張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)視野取平均值，同時(shí)觀察該區(qū)域GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。利用Image Pro Plus 5.0圖像分析軟件分析，取每張切片中GFAP陽性細(xì)胞的積分光密度（IOD）平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠死亡情況 空白對(duì)照組無死亡；甘露醇組死亡8只，存活18只；模型對(duì)照組死亡7只，存活19只?？偹劳雎蕿?8.8%（15／52）。

2.2 3組EB含量比較 模型建立后3d和7d，甘露醇應(yīng)用組、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組損傷側(cè)皮層EB濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），甘露醇應(yīng)用組和模型對(duì)照組EB比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

組別 損傷側(cè)皮層對(duì)側(cè)皮層3d 7d 3d 7d空白對(duì)照組 5.83±1.19 5.83±1.19 5.79±1.26 5.79±1.26模型對(duì)照組 65.40±9.271） 16.64±1.921） 6.83±1.37 5.54±0.58甘露醇應(yīng)用組 83.73±8.321）2） 19.44±2.351）2） 12.23±0.89 6.75±2.31與空白對(duì)照組，1）P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01

2.3 行為學(xué)及腦電圖觀察 空白對(duì)照組未觀察到癲癇發(fā)作；實(shí)驗(yàn)組早期24h至7d內(nèi)有10只大鼠可以觀察到閉眼、胡須動(dòng)、面肌痙攣和節(jié)律性點(diǎn)頭等癥狀。模型建立7d后，3個(gè)月內(nèi)模型對(duì)照組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭癥狀，持續(xù)時(shí)間10s～30s；甘露醇組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭癥狀，1只出現(xiàn)前肢陣攣，本實(shí)驗(yàn)未觀察到3級(jí)以上的發(fā)作。甘露醇組與模型對(duì)照組癲癇發(fā)作的大鼠數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組大鼠腦電圖以9Hz～12Hz的α波或17Hz～19Hz的β波為主，波幅20 μV～80μV。慢性期癲癇大鼠EEG表現(xiàn)為背景節(jié)律增快，波幅為150μV～300μV，能觀察到明顯的棘波、尖波等。

2.4 GFAP陽性細(xì)胞形態(tài)觀察和計(jì)數(shù) 鏡下觀察可見皮層內(nèi)被染成棕褐色GFAP的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞呈彌散分布，細(xì)胞胞體腫脹，界限清晰，數(shù)量增多，突起增粗，胞核被蘇木素復(fù)染為深藍(lán)色，較小，居于細(xì)胞中央或偏位。對(duì)照組大鼠GFAP陽性細(xì)胞胞體較小，突起少而細(xì)。各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及IOD值見表2。甘露醇應(yīng)用組、模型對(duì)照組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及IOD值與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），甘露醇組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及IOD值（±s）

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及IOD值（±s）

分組 n 平均陽性細(xì)胞數(shù) 積分光密度（IOD）空白對(duì)照組 5 30.14±3.86 1289±368.45模型對(duì)照組 7 46.86±5.331） 2649±348.591）甘露醇應(yīng)用組 7 52.76±6.521）2） 3210±398.241）2）與空白對(duì)照組，1）P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本研究我們通過自由落體致重型顱腦損傷模型研究血腦屏障破壞與癲癇發(fā)作之間的關(guān)系，給予1 200g＊cm的打擊力度造成重型顱腦損傷，損傷的程度越大動(dòng)物死亡率越高，中重度顱腦損傷死亡率高達(dá)30%～40%[7]，本實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率為28.8%（15／52），與文獻(xiàn)報(bào)道相近。實(shí)驗(yàn)組分別給予尾靜脈注射生理鹽水和甘露醇后發(fā)現(xiàn)，甘露醇能進(jìn)一步開放血腦屏障（P＜0.01），但3個(gè)月期間觀察兩組大鼠的致癲癇率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分析認(rèn)為一方面是由于樣本數(shù)量較少，另一方面是觀察周期的限制，研究認(rèn)為大鼠外傷后需經(jīng)過大約6周至11個(gè)月，平均7個(gè)月才會(huì)有約50%的大鼠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作[8]。但兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明血腦屏障開放程度越大，膠質(zhì)細(xì)胞增生越明顯。

外傷后往往出現(xiàn)血腦屏障的破壞[9]，近年來，血腦屏障的破壞被認(rèn)為在癲癇形成過程中發(fā)揮重要作用[10]7年Cornford等[11]首先通過觀察超微結(jié)構(gòu)研究了血腦屏障與癲癇的關(guān)系，隨后的試驗(yàn)也證實(shí)了血腦屏障破壞后經(jīng)過一定潛伏期能夠誘發(fā)癲癇發(fā)作[12]，van Vliet等[10]用甘露醇人為造成血腦屏障開放，發(fā)現(xiàn)已患有慢性癲癇的大鼠其發(fā)作頻率較前明顯增加，這提示血腦屏障通透性的改變可能是癲癇發(fā)作的重要機(jī)制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)血腦屏障破壞后白蛋白滲出在癲癇的發(fā)生中起了重要作用，本研究也證實(shí)血腦屏障開放后能夠引起白蛋白滲出，而且開放程度越大，白蛋白滲出量越多，白蛋白外溢導(dǎo)致腦組織直接暴露于血清白蛋白足以引起癲癇發(fā)生[13]，且白蛋白引發(fā)的癲癇活動(dòng)強(qiáng)度表現(xiàn)為劑量依賴式[14]。而白蛋白滲出后是如何引起癲癇發(fā)作的，Tomkins等[15]認(rèn)為無論是血腦屏障破壞還是將白蛋白直接暴露于腦組織，都會(huì)引起膠質(zhì)細(xì)胞激活，使其對(duì)鉀離子的緩沖減弱，細(xì)胞外K＋增高，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮。Cacheaux等[16]研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白溢出到腦組織后通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（TGF－βRs）被膠質(zhì)細(xì)胞攝取，引起鉀內(nèi)向整流通道（Kir4.1）表達(dá)減少，細(xì)胞外鉀離子積累增加，導(dǎo)致N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇樣活動(dòng)[17]。血腦屏障破壞后，損傷處的腦組織就開始進(jìn)行一系列的病理變化：神經(jīng)元壞死和膠質(zhì)細(xì)胞增生[3]，而這些膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，一般涉及星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化和數(shù)量增加[18]，本研究也證實(shí)血腦屏障破壞后，會(huì)出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，而且血腦屏障開放程度越大，膠質(zhì)細(xì)胞增生的數(shù)量越多。星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活是其增生的基礎(chǔ)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞外Na＋／K＋濃度平衡失調(diào)，使神經(jīng)細(xì)胞興奮的閾值降低，神經(jīng)活動(dòng)過度而發(fā)生癲癇[19]。Vessal等[20]給已經(jīng)發(fā)生癲癇的大鼠分別注射生理鹽水和L－AA（一種阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的氨基酸）觀察發(fā)現(xiàn)，給予阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞增生后，大鼠癲癇發(fā)作程度明顯減輕，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生在癲癇反復(fù)發(fā)作中起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在腦外傷后的1周左右可觀察到大鼠點(diǎn)頭、面肌痙攣等癲癇樣癥狀，推測(cè)與BBB破壞后早發(fā)性神經(jīng)元異常放電有關(guān)[21]，癲癇發(fā)作可發(fā)生在外傷后早期，但外傷性癲癇需在外傷后數(shù)月甚至數(shù)年才會(huì)發(fā)生[15]，然而早發(fā)性癲癇的出現(xiàn)卻可以大大增加患者發(fā)生晚發(fā)性癲癇的風(fēng)險(xiǎn)[22]。外傷性癲癇指外傷后1周出現(xiàn)的反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作，又稱遲發(fā)型癲癇，以區(qū)別1周內(nèi)發(fā)生的早發(fā)行癲癇或24h內(nèi)出現(xiàn)的即時(shí)發(fā)作性癲癇，但這種定義在動(dòng)物模型中尚未定義[8]。在人類外傷后早發(fā)性癲癇的發(fā)生率約為2.1%～16.9%，以兒童多見[2]。

血腦屏障破壞后引起血清白蛋白外滲到腦組織，血清白蛋白通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體被膠質(zhì)細(xì)胞攝取引起膠質(zhì)細(xì)胞激活和增生，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇發(fā)作，而增生的異常星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持癲癇復(fù)發(fā)中起著重要作用。血腦屏障破壞在外傷性癲癇的發(fā)生、發(fā)展中扮演者重要角色，這對(duì)研究人類外傷性癲癇的機(jī)制有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)因樣本數(shù)量及觀察周期限制有其局限性，這需要進(jìn)一步去研究，膠質(zhì)細(xì)胞激活后究竟釋放何種因子及具體相關(guān)機(jī)制仍需做更深的探討。

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