胡欣妍

動脈粥樣硬化類疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，目前一 致認(rèn)為，動脈粥樣硬化的病理本質(zhì)是動脈內(nèi)膜的慢性炎癥。動脈粥樣硬化在各種危險因素如病毒、機械損傷、糖尿病等引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷或者功能失調(diào)，血管內(nèi)膜產(chǎn)生一種過度的慢性炎性增生反應(yīng)[1]。血脂異常，尤其氧化修飾低密度脂蛋白（ox－LDL）是最重要的致動脈粥樣硬化危險因素。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，MAPK包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶（ERK）、c－jun N 端激酶（JNK）／應(yīng)激激活的蛋白激酶（SAPK）和P38。它們參與多種胞外啟動信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡的作用。腎素（前體）受體[（P）RR]是Nguyen等在2 0 0 2年克隆出的，（P）RR表達在各種細(xì)胞中，如神經(jīng)細(xì)胞、腎小球系膜、單核細(xì)胞、心肌和平滑肌細(xì)胞[2－7]，由350個氨基酸組成，含有1個非糖基化且高度疏水的氨基末端，該區(qū)域與腎素／腎素前體的結(jié)合有關(guān)，還含有1個由20個氨基酸構(gòu)成的尾部。本研究旨在觀察ox－LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的ERK1／2信號通路的激活及（P）RR的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康產(chǎn)婦臍帶由大連市婦產(chǎn)醫(yī)院提供。氧化低密度脂蛋白購自Sigma公司；Renin Receptor siRNA購自Santa公司；兔抗 人 p－ERK1／2 抗 體，ERK1／2 抗 體，β－actin購 自 BIOWORLD公司；RNAiso、RT－PCR試劑盒及引物購自TaKaRa公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗購自Invitrogen公司；siRNA Transfection Reagent購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 無菌采集健康新生兒臍帶，長約20cm，用PBS將其沖洗干凈，向臍靜脈中注入0.1%Ⅱ型膠原酶，收集消化液離心棄上清，收集細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，加入胰蛋白酶溶液進行傳代，將2代～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組及檢測指標(biāo) 不同濃度ox－LDL（0mg／L、25 mg／L、50mg／L、100mg／L、150mg／L）與 HUVECs共同作用15min。濃度為100mg／L的ox－LDL不同時間，即0min、15 min、3 0min、6 0min、1 2 0min，用 Western blot方 法 檢 測p－ERK 1／2、ERK 1／2蛋 白 。RNA干 擾 對HUVECs表 達（P）RRmRNA的影響：空白組；RNA干擾組：siRNA分別轉(zhuǎn)染HUVECs 2 4h、4 8h、7 2h；轉(zhuǎn)染試劑組：轉(zhuǎn)染試劑1處理HUVECs2 4h、4 8h、7 2h，用RT－PCR的方法檢測（P）RR mRNA。（P）RR在ox－LDL激活 HUVECs表達ERK1／2通路的作用：空白組；奧美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）；奧美沙坦 （10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL 組；siRNA轉(zhuǎn)染＋奧美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）組；siRNA轉(zhuǎn)染＋奧美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL組；轉(zhuǎn)染試劑＋奧美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL組。用 Western blot方法檢測p－ERK1／2、ERK1／2蛋白。

1.2.3 RT－PCR方法 提取HUVECs的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（P）RR上游 PCR引物序列：5′－ATTGGCCTATACCAGGAGAG－3′；（P）RR 下 游 PCR 引 物 序 列：5′－TTCCCCATAACGCTTC CCAA－3′。進行PCR擴增：取PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，然后凝膠成像儀成象。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡 提取各組HUVECs總蛋白，在SDS凝膠上電泳，轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，加入兔抗人p－ERK1／2、ERK1／2抗體，4℃孵育過夜。充分洗膜后加入羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗，37℃3h，充分洗膜后，加入ECL反應(yīng)體系，曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度ox－LDL對HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影響 25mg／L～150mg／L的ox－LDL均能引起 HUVECsERK1／2信號通路的磷酸化增加，以濃度為100mg／L的ox－LDL作用最強。詳見圖1。

圖1 不同濃度ox－LDL對HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影響

2.2 ox－LDL（100mg／L）不同時間對 HUVECs的 ERK1／2通路磷酸化的影響 ox－LDL引起HUVECs的ERK1／2通路磷酸化增加，從5min開始增加，15min達高峰，此后開始下降。詳見圖2。

圖2 ox－LDL（100mg／L）不同時間對 HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影響

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 HUVECs對 HUVECs表達（P）RRm RNA的影響 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs，可明顯減少HUVECs表達（P）RRm RNA，以72h作用最明顯。詳見圖3。

圖3 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs對HUVECs表達（P）RRm RNA的影響

2.4 RNA干擾（P）RR對HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影響 在用奧美沙坦和PD123319阻斷AT1和AT2受體的情況下，ox－LDL 引 起 HUVECs的 P－ERK1／2增 加，RNA 干 擾（P）RR表達后，可以明顯抑制ox－LDL可引起HUVECs的P－ERK1／2增加，說明（P）RR可以不依賴于血管緊張素Ⅱ，參與激活HUVECs的ERK1／2通路。詳見圖4。

圖4 RNA干擾（P）RR對HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影響

3 討 論

在MAPK家族中，人們發(fā)現(xiàn)得最早、研究得最透徹的是ERK通路。多種刺激因素，如血栓素A2、血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子等都可激活ERK。通過磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子，將來自細(xì)胞外刺激信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達，與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、組織入侵和轉(zhuǎn)移有關(guān)。P（RR）是腎素、腎素前體的功能性受體，不但能夠與腎素、腎素前體結(jié)合，還可介導(dǎo)生物學(xué)功能。腎素與（P）RR結(jié)合可使腎素的活性增加為游離腎素的4～5倍。腎素前體與（P）RR結(jié)合會引起腎素前體分子構(gòu)象發(fā)生改變而被激活，同時增加了血管緊張素－Ⅰ的產(chǎn)生，并可直接激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAP激酶的ERK1／2和P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、熱休克蛋白27激酶、PI3K－P85[8]等通路，調(diào)節(jié)某些基因的表達，進而導(dǎo)致細(xì)胞纖維化、生長和重塑。

本實驗用奧美沙坦和PD123319阻斷血管緊張素Ⅱ的AT1和AT2受體，排除了ox－LDL、腎素、腎素前體通過使血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生增加，進而作用于其受體而發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA（P）RR轉(zhuǎn)染 HUVECs72h，可以明顯抑制（P）RRmRNA 的表達。并且抑制了ox－LDL對HUVECs的ERK1／2信號通路的激活。這說明（P）RR參與了ox－LDL激活HUVECs的ERK1／2通路。推測ox－LDL在增加HUVECs表達腎素、腎素前體，進而腎素、腎素前體作用于（P）RR激活 HUVECs的ERK1／2通路。抑制（P）RR的表達，可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的ERK1／2同路的激活，這為抑制ox－LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞的ERK1／2通路的激活，提供了一個新的治療方法。

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