布威海麗且姆·阿巴拜科日 木塔力甫·艾買提 阿米尼姑麗·買買提

尼砸木·艾海提 依米提·熱合曼

蜂膠的化學(xué)組分非常復(fù)雜，生物學(xué)活性多樣［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，蜂膠總黃酮具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種生物活性作用［2］。國(guó)內(nèi)外大量的科學(xué)研究證明，蜂膠對(duì)機(jī)體的諸多保健功效與其抗氧化活性有著密切的關(guān)系［1］。蜂膠中含有豐富的黃酮類化合物，其品種和含量之豐富，非植物藥所能相比，目前世界各地蜂膠樣品中分離出來的黃酮類化合物已有70多種［3］。新疆大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從新疆伊犁蜂膠的95％乙醇提取物中采用GC-MS法已鑒定了23種化合物，其主要成分為黃酮類物質(zhì)［4］。蜂膠中的黃酮類化合物主要包括黃酮醇類、黃酮類和黃烷酮類。常見的黃酮醇類有槲皮素、良姜素、蘆丁等；黃酮類主要有芹菜素、白楊素等；二氫黃酮類主要有松屬素等；異黃酮有后莫紫檀素等［5-7］。多種藥用植物中的現(xiàn)有研究已表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等多方面藥理作用，能提高免疫能力、對(duì)冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用，成為近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱門課題［8］。大量研究表明，白楊素還具有抗病毒［9］、抗高血壓［10］、抗糖尿病［11］、抗菌抗過敏［12］等作用。由于白楊素對(duì)常見病、多發(fā)病所具有的重要的生理作用，也引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，對(duì)蜂膠成分的分析主要采用高效液相色譜法［13-15］。蜂膠中的黃酮類化合物、咖啡酸酯類等成分都具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力［16］。蜂膠抗氧化活性的測(cè)定方法，包括清除羥自由基和氧自由基能力測(cè)定法、β-胡蘿卜素一亞油酸法、清除1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自 由 基 法、2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）［2，2-azinobis（3-ethly-binzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS2］ 陽離子脫色法、鐵還原抗氧化能力測(cè)試法（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、氧化自由基吸收能力測(cè)定法（oxygen radical absorption capacity，ORAC）等［17］。蜂膠的化學(xué)成分及其各種生物學(xué)活性取決于其收集產(chǎn)地［18］，因此，產(chǎn)地是影響蜂膠抗氧化活性的重要因素之一。有關(guān)研究證明，澳大利亞、中國(guó)、匈牙利、新西蘭的蜂膠清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)，清除能力達(dá)60％以上。不同蜂膠樣品中清除DPPH自由基活性和總多酚含量之間呈正相關(guān)R2=0.762。多酚含量與抗氧化作用具有顯著性相關(guān)R2=0.671［19］?？梢姡宄鼶PPH自由基法是檢測(cè)抗氧化活性的有效、快速方法。

王小平等［20］對(duì)河南、山東、甘肅、內(nèi)蒙產(chǎn)的蜂膠中的槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定分析，由于新疆所處的特殊地理位置和氣候條件，就藥用植物的種類與其他省、自治區(qū)相比有較大的差異，很多種類屬新疆特有種，蜜源植物是蜜蜂賴以生存，及蜂臘、蜂膠等各種蜂產(chǎn)品的物質(zhì)基礎(chǔ)。新疆野生蜜源植物比較豐富，約有200種。由于受生態(tài)系統(tǒng)和氣候條件的影響，植物滲出物和分泌物的不同導(dǎo)致了不同地區(qū)采集的蜂膠化學(xué)成分的差異，生物學(xué)活性也因此有所變化，所以新疆產(chǎn)蜂膠的化學(xué)成分與生物學(xué)活性與其他種類也必然存在較大的差異。就這一科研領(lǐng)域，尚未見有關(guān)基于新疆產(chǎn)蜂膠進(jìn)行抗氧化活性及其活性成分槲皮素和白楊素含量測(cè)定研究的報(bào)道。本研究首先從新疆產(chǎn)蜂膠有效成分的提取及其抗氧化作用著手，采用超聲波提取法和不同有機(jī)溶劑提取蜂膠，檢測(cè)其對(duì)DPPH自由基的清除能力和抗亞油酸過氧化能力，進(jìn)一步檢測(cè)其生物活性物質(zhì)——黃酮類化合物，將其開發(fā)成天然抗氧化物質(zhì)；其次利用比較先進(jìn)的研究方法對(duì)新疆產(chǎn)蜂膠活性成分槲皮素和白楊素的含量進(jìn)行分析，旨在對(duì)新疆產(chǎn)蜂膠產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及來源 蜂膠取自新疆伊犁尼勒克縣和阿克蘇庫(kù)車縣養(yǎng)蜂場(chǎng)，采集時(shí)間：秋季。純度均為98％的槲皮素對(duì)照品和白楊素對(duì)照品（金測(cè)分析技術(shù)天津有限公司）。

1.1.2 儀器和試劑 篩子（60-120目）；PYX-DHS-40X50-B型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；λ-17型紫外可見光譜儀（PE美國(guó)，波長(zhǎng)范圍190-900nm，準(zhǔn)確度±0.3）；HP1100高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，原惠普公司）；JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧伯新芝生物科技股份有限公司）；2GKC14型控溫水浴鍋、冷柜、定量濾紙、容量瓶、電子天平、燒杯、移液管；DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼，C18H12N5O6，相對(duì)分子質(zhì)量394.3，F(xiàn)luka公司）、硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA）、亞油酸、無水乙醇、茶多酚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸、醋酸鉀、丙酮等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 蜂膠的提取

1.2.1.1 預(yù)處理 將原料蜂膠放入冰箱冷凍5h（蜂膠在15℃以下變硬變脆，在此溫度以上具有黏性，不便粉碎），粉碎，過40目篩。分別標(biāo)準(zhǔn)稱取3g伊犁和庫(kù)車原蜂膠并加上150mL蒸餾水，在65℃放置4h后拋棄蜂蠟和濾雜，備用。

1.2.1.2 蜂膠的各溶劑提取 分別稱取預(yù)處理過的蜂膠→分別加入15倍體積的各溶劑（80％乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇）→在超聲波細(xì)胞粉粹機(jī)處理20min（20℃）→過濾→放65℃水浴鍋，干燥→稱重（計(jì)算提取率）→避光處保存，備用。1.2.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

1.2.2.1 測(cè)定原理 DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在517nm附近有強(qiáng)吸收（顯深紫色）。當(dāng)有機(jī)清除劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，通過測(cè)定吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性。

1.2.2.2 測(cè)定方法 秤取將茶多酚和已提取備用的蜂膠用80％乙醇配制成質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80和100μg/mL的系列樣品。準(zhǔn)確稱取DPPH試劑0.098 6g，用無水乙醇溶解定容至500mL容量瓶中，得到DPPH貯備液濃度為197.2mg/mL，搖勻置于冰箱中冷藏備用。使用時(shí)，將DPPH貯備液稀釋成濃度為39.44mg/mL DPPH溶液。

取2mL DPPH溶液溶解待測(cè)物，充分混合，靜置40min。在517nm處測(cè)定其吸光度。每個(gè)樣品平行做3次。各待測(cè)物對(duì)DPPH的清除率K，可由下列公式：

K=［1-（Ai-Aj）］/Ac×100％

其中，K為樣品對(duì)DPPH自由基的清除率；Ai為2mL DPPH溶液+ 2mL待測(cè)試液的吸光度；Aj為2mL待測(cè)試液+2mL乙醇的吸光度；Ac為2mL DPPH溶液+2mL乙醇的吸光度。

1.2.3 抗油脂過氧化力的測(cè)定［21］

1.2.3.1 測(cè)定原理 油脂發(fā)生過氧化反應(yīng)從其化學(xué)本質(zhì)來講，主要是油脂中含有不飽和脂肪酸。尤其是亞油酸和亞麻酸上含有的1，4戊二烯結(jié)構(gòu)使它們對(duì)氧化的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過油酸中丙烯體系，這種氧化作用又受到金屬離子如Fe2+、Cu2+的催化，氧化反應(yīng)一旦被啟動(dòng)，很容易形成鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速油脂的氧化酸敗。抗氧化劑作為氫給予體和自由基接受體起著抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用，從而使油脂過氧化反應(yīng)的發(fā)生受到一定的限制。該方法的原理是［22］：丙二醛是油脂被氧化后的產(chǎn)物，它可以與TBA反應(yīng)生成有色產(chǎn)物可在532nm下測(cè)定出其吸光值，吸光度值表示油脂氧化程度，其值越大，氧化程度越嚴(yán)重，當(dāng)油脂中加入抗氧化劑時(shí)，就會(huì)減少氧化反應(yīng)的發(fā)生從而降低丙二醛的含量。

1.2.3.2 測(cè)定方法［23］秤取將已提取備用的伊犁和庫(kù)車蜂膠用95％乙醇配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的蜂膠提取液。配制2.5％的亞油酸和95％乙醇溶液作底物溶液，分別加入已配好的0.2％蜂膠和95％乙醇提取物（1∶1），蜂膠的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％，向空白組不加蜂膠提取液。混勻后置于培養(yǎng)箱中于（40±1）℃下培養(yǎng)，定時(shí)取待測(cè)樣品1mL，加入1mL 25％的三氯乙酸，混勻，放置，終止反應(yīng)。然后加入1mL0.67％ TBA，于沸水浴中加熱10min。取出冷卻后加入4mL正丁醇，搖勻，于4000r/min離心10min，取上層正丁醇液，于532nm處測(cè)定光吸收值A(chǔ)，同時(shí)測(cè)定不加抗氧化物（蜂膠提取液）空白組的光吸收值A(chǔ)，吸光值越小表明抗氧化能力越強(qiáng)。

1.2.4 高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法分析蜂膠提取液的活性成分槲皮素和白楊素的含量

1.2.4.1 測(cè)定原理 當(dāng)流動(dòng)相（液體）中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

1.2.4.2 測(cè)定方法

（1）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：取一定濃度的槲皮素對(duì)照品溶液和白楊素甲醇溶液分別置于190-400nm和200-600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果分別在370nm和268nm波長(zhǎng)處有最大特征光吸收，此時(shí)檢測(cè)基線穩(wěn)定，槲皮素峰和白楊素峰前后雜質(zhì)峰干擾小，因此，對(duì)于槲皮素選擇370nm、對(duì)于白楊素選擇268nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

（2）原料預(yù)處理：將原料伊犁蜂膠放入冰箱冷凍5h（蜂膠在15℃以下變硬變脆，在此溫度以上具有黏性，不便粉碎），取原蜂膠5g，用研缽磨碎，過40目篩，加入50mL水，放入65℃水浴中4h，充分?jǐn)嚢?，除去蜂蠟和雜質(zhì)，置于順風(fēng)處，以便干燥備用。

（3）蜂膠的提?。簻?zhǔn)確稱取干燥并恒重的伊犁蜂膠樣品2g于燒杯中，分別精密加入50mL的70％乙醇和甲醇，稱定重量，超聲處理30min（20℃，600W），冷卻，再稱定重量，分別用70％乙醇和甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取濾液25mL，置于分液漏斗中，加石油醚（60-90℃）萃取2次，每次25mL。棄去石油醚液，分別取70％乙醇和甲醇液，置水浴上蒸干。將粉碎的伊犁蜂膠稱2.5g分別加入5倍的一定濃度的70％乙醇和甲醇提取溶液中，超聲處理30min（20℃，600 W）。30℃浸漬 48h，提出浸液，減壓回收70％乙醇和甲醇。

（4）供試品溶液的制備：精密稱取槲皮素和白楊素樣品0.2g，分開置于50mL 容量瓶中分別加70％乙醇和45mL甲醇使溶解，分別用70％乙醇和甲醇定容至劃度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，濾液作為供試品溶液，注入HPLC色譜儀，測(cè)定。

（5）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取槲皮素對(duì)照品5.0mg，置200mL容量瓶中，加70％乙醇166mL并搖勻，即得槲皮素對(duì)照品（濃度為30μg/mL）。精密稱取白楊素對(duì)照品5.0mg，置125mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得白楊素對(duì)照品溶液（濃度為 40μg/mL）。

（6）色譜條件：測(cè)定槲皮素的色譜條件-色譜柱 ：Spherisorb（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相 ：甲醇-16.7％四氫呋喃的0.4％磷酸溶液（38∶62）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm；柱溫：40℃。測(cè)定白楊素的色譜條件-色譜柱：Diamonsil CL8（5μm，4.6mm×200mm）；流動(dòng)相：甲醇 - 水（35：25）；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：268nm；柱溫為25℃。

（7）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：在選定的色譜條件下，分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液（0.03mg/mL）4、8、12、16、20μL 和白楊素對(duì)照品溶液（0.04mg/mL）2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μL，以依次注入 HPLC 色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄其色譜峰的峰面積積分值。以進(jìn)樣量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（8）精密度試驗(yàn)：精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度［24］，一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）表示，其數(shù)值一般不大于2.0％。RSD越小說明精密度越高，公式：

RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100％

本試驗(yàn)分別精密吸取槲皮素和白楊素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測(cè)定峰面積，記錄色譜，計(jì)算其RSD值。

（9）穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取各樣本供試品溶液，進(jìn)樣量為10μL，每隔4h測(cè)定一次，總共測(cè)24h，記錄色譜，計(jì)算結(jié)果。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)以Microsoft Excel和SPSS 10.0版統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)Ω鹘M數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方式對(duì)蜂膠提取率的影響

各溶劑提取物分別加入已準(zhǔn)確稱重的干燥空燒杯中，放在65℃水浴鍋，待干燥后稱重，減去空燒杯的重量，所得的蜂膠提取率結(jié)果如表1所示。

由表1可知，庫(kù)車蜂膠的提取率高于伊犁蜂膠，對(duì)伊梨蜂膠正丁醇提取法的提取率（26％）最高，正丁醇可做為最佳提取溶劑；對(duì)庫(kù)車蜂膠丙酮提取法的提取率（36％）最高，丙酮可做為最佳提取溶劑。

表1 蜂膠在不同提取法中的提取率

2.2 不同蜂膠提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

當(dāng)伊犁和庫(kù)車蜂膠各溶劑提取物系列濃度為10-100μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力結(jié)果（表2）顯示，伊犁和庫(kù)車蜂膠各溶劑提取物和茶多酚的各濃度液對(duì)DPPH清除率的均值比較，蜂膠在有機(jī)溶劑正丁醇里溶解成分的抗氧化能力最強(qiáng)。從表中可以看出伊梨蜂膠各溶劑提取物濃度為10-100μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力為：80％乙醇＞正丁醇＞丙酮＞乙酸乙酯，清除率越高就表明抗氧化能力越強(qiáng)；結(jié)果表明在此濃度的4種提取溶劑里80％乙醇提取物的抗氧化能力最強(qiáng)；與對(duì)照品（茶多酚）相比，80％乙醇提取物的抗氧化能力在6種濃度梯度下都高于茶多酚。庫(kù)車蜂膠各溶劑提取物系列濃度為10-100μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力為：正丁醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞80％乙醇，結(jié)果表明在此濃度的4種提取溶劑里正丁醇提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，與對(duì)照品（茶多酚）相比正丁醇提取物的抗氧化能力在6種濃度梯度下都高于茶多酚。

表2 伊梨蜂膠和庫(kù)車蜂膠各溶劑提取物及茶多酚對(duì)DPPH自由基的清除率

2.3 蜂膠的抗油脂過氧化作用

如圖1所示，532nm處吸光值隨油樣作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。0.1％蜂膠+95％乙醇提取物作為抗氧化劑添加到油樣中，提高了油樣的抗氧化性，吸光值低于未加抗氧化劑組（空白）。

從圖1可知在第6天時(shí)亞油酸氧化達(dá)到最高值，伊犁蜂膠提取物的A值比庫(kù)車蜂膠提取物的A低，表明其抗氧化效果較好。隨著氧化的后期，由于分解的醛類物質(zhì)受到再氧化生成酸，因此油脂酸敗至一定程度時(shí)，其丙二醛物質(zhì)生成減少，TBA值有下降的趨勢(shì)，即測(cè)得的A值下降，表明油脂已劇烈酸敗。

圖10.1％蜂膠+95％乙醇提取物對(duì)亞油酸抗氧化作用

2.4 HPLC法測(cè)定蜂膠提取液的活性成分槲皮素和白楊素的含量

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 在選定的色譜條件下，分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液（0.03mg/mL）4、8、12、16、20μL和白楊素對(duì)照品溶液（0.04mg/mL）2.5、5.0、10.0、15.0和 20.0μL，以依次注入 HPLC色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，分別記錄其色譜峰的峰面積積分值。濃度與峰面積線性關(guān)系見表3。

分別以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)色譜峰峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素回歸方程：y=15.464x+2.7166，R2=0.9994；白楊素回歸方程：y=5.9351x-9.7648，R2=1，式中 x為濃度（μg/mL），y為峰面積。槲皮素和白楊素含量分別在1.91-19.11μg/mL和37.24-372.40μg/mL范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

表3 槲皮素、白楊素濃度與峰面積線性關(guān)系

2.4.2 槲皮素及白楊素樣品含量的測(cè)定 按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液20μL，注入HPLC色譜儀，測(cè)定。結(jié)果（表4）表明，伊犁蜂膠中與槲皮素相比白楊素的含量較高；對(duì)槲皮素而言，與乙醇提取劑相比，以甲醇為提取溶劑時(shí)蜂膠中槲皮素的含量較高、樣品提取率高、提取效果好；而對(duì)白楊素而言，與未經(jīng)脫脂的甲醇提取液相比未經(jīng)脫脂的乙醇提取液里樣品中白楊素的含量較高；分別將乙醇和甲醇提取液直接注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，樣品中槲皮素和白楊素含量較低。但經(jīng)采用石油醚萃取，脫脂，除去脂溶性雜質(zhì)，此時(shí)樣品中槲皮素和白楊素含量都比未經(jīng)脫脂的高，分離效果最佳。

圖2 槲皮素（A）和白楊素（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 槲皮素、白楊素樣品含量測(cè)定

2.4.3 對(duì)照品的HPLC分析 按以上選定色譜條件，分別精密吸取槲皮素和白楊素對(duì)照品溶液20μL注入HPLC色譜儀，測(cè)定。槲皮素和白楊素的保留時(shí)間分別為t=3.983min、t=10.374min，結(jié)果如圖3、圖4所示。

2.4.4 樣品的HPLC色譜分析 分別精密吸取未經(jīng)脫脂的乙醇蜂膠提取液、未經(jīng)脫脂的甲醇蜂膠提取液、經(jīng)脫脂的乙醇蜂膠提取液、經(jīng)脫脂的甲醇蜂膠提取液各吸取20μL，注入HPLC色譜儀，測(cè)定結(jié)果如圖5 -圖8所示，相應(yīng)的保留時(shí)間見表5。

圖 3 槲皮素對(duì)照品的HPLC分析圖

圖4 白楊素對(duì)照品的HPLC分析圖

由圖5-圖8可以看出，各蜂膠提取液中有很多成分，此結(jié)果與槲皮素和白楊素對(duì)照品的HPLC色譜分析圖相比，未經(jīng)脫脂的乙醇蜂膠提取液、未經(jīng)脫脂的甲醇蜂膠提取液、經(jīng)脫脂的乙醇蜂膠提取液、經(jīng)脫脂的甲醇蜂膠提取液都包含槲皮素和白楊素。表5說明蜂膠經(jīng)過脫脂，除去脂溶性雜質(zhì)以后，縮短了出現(xiàn)槲皮素峰和白楊素峰的保留時(shí)間。

圖 5 未經(jīng)脫脂的乙醇提取液的HPLC分析圖

圖 6 經(jīng)脫脂的乙醇提取液的HPLC分析圖

圖 7 未經(jīng)脫脂的甲醇提取液的HPLC分析圖

圖 8 經(jīng)脫脂的甲醇提取液的HPLC分析圖

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取槲皮素和白楊素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次的進(jìn)樣量均為10μL注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜，結(jié)果（表6）顯示，槲皮素峰的平均峰面積值為60.96，RSD為0.86％；白楊素峰的平均峰面積值為431.16，RSD為0.26％。試驗(yàn)結(jié)果表明，該法測(cè)定蜂膠中槲皮素和白楊素含量的重復(fù)性良好，儀器的精密度較高。

表 5 樣品的HPLC色譜分析表

表 6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取槲皮素和白楊素供試品溶液，進(jìn)樣量均為10μL，注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，每隔4h測(cè)定一次，總共測(cè)24h，記錄色譜。測(cè)定結(jié)果（表7）顯示，槲皮素峰平均峰面積值為169.03，RSD為1.89％；白楊素峰的平均峰面積值為1631.73，RSD為1.11％。試驗(yàn)結(jié)果表明，本品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，其峰面積基本不變。

表 7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，迄今已發(fā)現(xiàn)300多種成分［18］。隨著人們對(duì)蜂膠的認(rèn)識(shí)和研究的深入，經(jīng)過充分的考核考察，蜂膠有可能因其資源豐富、效果顯著、提取方便等優(yōu)點(diǎn)而成為具有前途的天然抗氧化劑新資源［25］。

蜂膠的功效成分主要是黃酮類化合物，如槲皮素、白楊素等和酚類化合物，本研究首先針對(duì)新疆伊犁和庫(kù)車蜂膠采用4種不同溶劑進(jìn)行提取得到一系列蜂膠提取物，對(duì)其進(jìn)行了抗氧化活性的測(cè)定，并進(jìn)一步定性分析了黃酮類物質(zhì)；其次采用高效HPLC色譜法對(duì)新疆伊梨蜂膠中槲皮素和白楊素的含量進(jìn)行了測(cè)定。新疆伊犁蜂膠和庫(kù)車蜂膠的提取率具有一定的差異，即庫(kù)車蜂膠的提取率較高，但它們的抗氧化活性之間無明顯差異，表明蜂膠提取率和抗氧化活性之間沒有相關(guān)性，原蜂膠的雜質(zhì)成分可能影響了其提取率。蜂膠的收集產(chǎn)地和原蜂膠的不同溶劑法提取可能會(huì)引起蜂膠提取物在活性成分含量的差異，很可能正是這種差異影響了其抗氧化能力。本次試驗(yàn)中新疆兩個(gè)地區(qū)蜂膠抗氧化活性之間無明顯差異，而且這兩個(gè)地區(qū)的地理環(huán)境和植被分布很相似，表明其蜂膠活性成分也很相近。

蜂膠是含有樹脂狀物的黏性物質(zhì)，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇和甘油等有機(jī)溶劑。本試驗(yàn)用70％乙醇和甲醇作為提取溶劑從新疆伊犁蜂膠中提取槲皮素和白楊素。結(jié)果表明，伊犁蜂膠中與槲皮素相比白楊素的含量較高；對(duì)槲皮素而言，與乙醇提取劑相比，以甲醇為提取溶劑時(shí)蜂膠中槲皮素的含量較高、樣品提取率高、提取效果好；而對(duì)白楊素而言，與未經(jīng)脫脂的甲醇提取液相比未經(jīng)脫脂的乙醇提取液里樣品中白楊素的含量較高。經(jīng)過HPLC分析，活性成分槲皮素和白楊素從新疆伊梨蜂膠樣品中可被檢測(cè)出，而二者在本研究的色譜條件下，分離度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且峰形對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象，雜質(zhì)也無干擾。通過穩(wěn)定性及回收率試驗(yàn)，顯示本方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。用不同的方法提取的蜂膠中槲皮素和白楊素的含量也不同，即分別將乙醇和甲醇提取液直接注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，樣品中槲皮素和白楊素含量較低，但經(jīng)采用石油醚萃取、脫脂、除去脂溶性雜質(zhì)，此時(shí)樣品中槲皮素和白楊素含量都比未經(jīng)脫脂的高，分離效果最佳，并縮短了出現(xiàn)槲皮素峰和白楊素峰的保留時(shí)間。

新疆具有豐富的蜂膠資源，蜂膠的生物學(xué)活性與化學(xué)成分受生態(tài)系統(tǒng)和氣候條件的影響。蜂膠成分主要取決于其收集產(chǎn)地，對(duì)新疆產(chǎn)蜂膠抗氧化活性及活性成分槲皮素和白楊素的含量分析研究，以及開發(fā)具有醫(yī)療營(yíng)養(yǎng)保健功能的蜂膠產(chǎn)品及其制品，盡快實(shí)現(xiàn)新疆蜂膠產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化，將具有理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

通過對(duì)蜂膠中活性物質(zhì)的提取與其抗氧化作用的初步研究表明，采用超聲波提取的蜂膠各溶劑提取物具有比較強(qiáng)的抗氧化能力，能明顯清除DPPH自由基；蜂膠的采樣地點(diǎn)和提取溶劑不同，其抗氧化能力也有所不同，待進(jìn)一步進(jìn)行新疆蜂膠新活性成分的分離純化和產(chǎn)業(yè)化。測(cè)定波長(zhǎng)分別為370nm和268nm時(shí)，經(jīng)過HPLC分析活性成分槲皮素和白楊素從新疆伊犁蜂膠樣品中可被檢測(cè)出；槲皮素和白楊素濃度分別在1.91-19.11μg/mL和37.24-372.40μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其相應(yīng)的R2值為0.9994和1。

［1］ 胡福良.蜂膠藥理作用研究［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社,2005.

［2］ 胡福良, 玄紅專.蜂膠的生物學(xué)活性及毒性和過敏反應(yīng)［J］.科技通報(bào), 2003, 19（2）：166-169.

［3］ 郭伽, 周立東.膠的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中國(guó)養(yǎng)蜂, 2000,51（2）：21-22.

［4］ Mamet A, Amet M, 等.新疆產(chǎn)蜂膠提取物對(duì)農(nóng)作物病原真菌的抗性作用［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 48（9）：1716-1722.

［5］ 趙玉娟.高效液相色譜法測(cè)定蜂膠中的黃酮成分［J］.現(xiàn)代儀器 , 2000（4）：22-24.

［6］ Alcncar SM, Oldoni TLC, Castro ML, et al.Chemical composition and biological activity of a new type of Brazilian pmpolis：Red propolis［J］.Journal of Ethnopharmacology, 2007（113）：278-283.

［7］ 宋愛清, 劉杰.HPLC法測(cè)定蜂膠中黃酮類化合物的含量［J］.中國(guó)養(yǎng)蜂, 2001（3）：10-11.

［8］ 王艷芳, 王新華, 朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2003, 15（2）：171-173.

［9］ Emepyanov AV, Kovac CR, Sepulveda MA, et al.The interaction of Pax5（BSAP）with Daxx can result in tarnscriptional activation in B cells［J］.J Biol Chem, 2002, 277（13）：11156-11164.

［10］ Maul GG, Negorev PB, Ishov AM.Review ：properties and assemblymechanisms of ND10, PML bodies, or PODs［J］.J Struc Biol, 2000, 129：278-287.

［11］ Sternsdorf T, Grotzinger T, Jensen K, et al.Nuclear dots：actors onmany stages［J］.Immuno, 1997, 198（1-3）：307-331.

［12］ Harborne JB, Williams CA.Advances in flavonoid research since 1992［J］.Phytochemistry, 2000, 55（6）：481-483.

［13］ Ahn MR, Kumazawa S, Hamasaka T, et al.Antioxidant activity andconstituents of propolis collected in various areas of Korea［J］.Agric Food Chem, 2004, 52（24）：7286-7292.

［14］ Kumazawa S, Hamasaka T, Nakayama T.Antioxidant activity of propolis of various geographic origins［J］.Food Chemistry, 2004,84（3）：329-339.

［15］ Kumazawa S, Hayashi K.Studies of the constituents of Uruguayan propolis［J］.Agric Food Chem, 2002, 50（17）：4777-4782.

［16］ 林賢統(tǒng), 朱威, 胡福良.不同溶劑提取蜂膠的得率及其提取物的抗氧化性［J］.蜜蜂雜質(zhì), 2008（7）：3-5.

［17］ 續(xù)潔琨, 姚新生, 等.抗氧化能力指數(shù)（ORAC）鋇O定原理及應(yīng)用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22（8）：1015-1021.

［18］ Jasprica I, Momar A, Debeljak ?, et al.In vivo study of propolis supplementation effects on antioxidative status and red blood cells［J］.Ethnopharmacol, 2007, 110（3）：548-549.

［19］ 玄紅專, 胡福良.不同地區(qū)蜂膠抗氧化活性與化學(xué)組分的研究進(jìn)展［J］.蜜蜂雜志, 2009（2）：7-10.

［20］ 王小平, 林勵(lì), 白吉慶.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地蜂膠中槲皮素的含量［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 32（3）：30-32.

［21］ 沈建福, 張英.竹葉黃酮糖苷的水解及其苷元的抗氧化性能研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2001, 16（4）：14-16.

［22］ 楊淑珍, 張友勝, 彭麗桃, 等.二氫楊梅樹皮素的抗氧化效果研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2004, 19（2）：82-84.

［23］ 孟浩, 杭瑚.柯子抗氧化作用的研究［J］.食品科學(xué), 2002,21（2）：9-12.

［24］ 張燕, 林松毅, 劉靜波, 等.反高效液相色譜法測(cè)定篤斯越桔葉片中槲皮素含量［J］.食品科學(xué), 2007, 28（11）：404-406.

［25］ 乞永艷, 駱尚驊, 劉富海.蜂膠抗氧化作用研究進(jìn)展［J］.蜜蜂雜志, 2000（12）：3-5.