白荷露 劉蕊 朱乃碩

我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18％，慢性乙型肝炎病毒感染者約9 300萬例［1］，每年由于HBV引起的肝硬化和肝癌造成263000人死亡［2］。HBV感染與原發(fā)性肝癌之間存在著密切關系，但由于缺乏有效的體外病毒感染和復制模型系統(tǒng)，乙肝及相關的原發(fā)性肝癌的基礎研究和臨床研究進展緩慢［3，4］。目前常用的HBV細胞模型HepG2.2.15細胞系，由于其HBV DNA已穩(wěn)定地整合入肝細胞的基因組并持續(xù)表達，這種靜態(tài)結果無法反映病毒的天然感染過程，在表達量和表達時間上不可調(diào)控，使得基因功能的研究產(chǎn)生了很大的局限。建立適合的HBV感染模型對于探索其感染機制，尋找有效的防治方法及開展抗HBV藥物的篩選都具有重要的意義［5-7］。因此，我們選用受四環(huán)素調(diào)控的Tet-On慢病毒系統(tǒng)來實現(xiàn)乙肝病毒X基因（以下簡稱HBx基因）的可調(diào)控表達［8］，并通過施與誘導劑的時間依賴性進行精確轉錄和翻譯，從而模擬HBV天然感染狀態(tài)以準確獲得靶基因的功能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

HBx基因來源于質(zhì)粒H85-T，該質(zhì)粒為本實驗室構建，含有C基因型，adr亞型的HBV病毒1.2倍基因組序列。菌株E.coli DH5α購自百泰克，人肝癌細胞株HepG2購自ATCC細胞庫。四環(huán)素誘導型慢病毒表達系統(tǒng)（Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System，包括調(diào)控質(zhì)粒pLVXTet-On-Advanced和表達質(zhì)粒pLVX-Tight-Puro），病毒滴度測定試劑盒（Lentil-XTMp24 Rapid Titer Kit）購自Clontech公司。PrimerStar高保真聚合酶，EcoR I、Not I限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶和dNTPs購自申能博彩公司。質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen公司。強力霉素，嘌呤霉素，Polybrene購自Sigma公司，G418購自Gibco公司。鼠抗HBxAg單抗購自Abcam公司，HRP標記的羊抗鼠IgG多抗、FITC標記的羊抗鼠IgG多抗、鼠抗GAPDH單克隆抗體購自上?？党缮锕尽Ｒ镉缮虾ＳⅡE生物技術有限公司合成，測序由上海博尚生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增HBx基因片段 HBx基因序列共465bp。根據(jù)實驗室已構建的含有C基因型，adr亞型的HBV1.2倍基因組序列的H85-T質(zhì)粒，設計X基因引物，由上海英駿生物技術有限公司合成。乙肝病毒X基因擴增引物選用Not I和EcoR I酶切位點，引物序列為XF：5'-ATTTGCGGCCGCATGGCTGCTAGGGTGT3'，XR：5'-CCGGAATTCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3'。

應用PrimerStar高保真聚合酶擴增HBx基因，PCR 反應條件為 ：98℃ 3min；98℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。采用切膠回收試劑盒回收PCR擴增條帶。

1.2.2 HBx基因慢病毒表達載體的構建 將HBx基因擴增回收產(chǎn)物和pLVX-Tight-Puro載體分別用限制性內(nèi)切酶Not I和EcoR I雙酶切后純化回收，T4連接酶連接過夜，轉化E.coli DH5α感受態(tài)，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒進行PCR，雙酶切和DNA測序驗證。

1.2.3 慢病毒的制備和滴度測定 在100mm的細胞培養(yǎng)皿中接種4×106-5×106HEK293T細胞，培養(yǎng)過夜使細胞密度達到80％左右，將3μg構建的表達載體質(zhì)粒與15μL的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾?，應用試劑盒中的磷酸鈣轉染試劑轉染到HEK 293T包裝細胞系中，8h后更換新鮮培養(yǎng)基，48h后收集培養(yǎng)上清，獲得包裝好的病毒顆粒，離心后分裝凍存。

采用病毒滴度測定試劑盒測定病毒P24含量（P24為HIV核心蛋白，其氨基酸序列高度保守，常用于病毒檢測），計算病毒的滴度。將收集的病毒上清液稀釋100倍后，與梯度稀釋的標準品一起加入包被有P24捕獲抗體的96微孔板中，依次加入生物素標記的P24抗體，HRP標記的鏈霉親和素，最終加入顯色液顯色。測定450nm吸光值（Spectrum M5微孔板檢測系統(tǒng)，Molecular Device公司），根據(jù)標準曲線換算P24的量（單位為pg/mL），計算病毒的滴度。換算公式為1ng≈1.25×107LPs（LP表示病毒顆粒數(shù)量）。

1.2.4 穩(wěn)定轉染的HBx基因的HepG2細胞系的構建和鑒定 將HepG2細胞以2×105的密度接種于6孔板中，含有四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA的病毒感染細胞，1200 g離心90min可提高感染效率。感染8h后換液用G418（600μg/mL）篩選，7-8d篩選穩(wěn)定后擴大培養(yǎng)，再用含有HBx基因的病毒感染，8h后換液用Puromycin（0.5μg/mL）篩選，3-4d篩選穩(wěn)定后擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定細胞株HepG2-HBx（reg）。

提取HepG2-HBx（reg）細胞基因組DNA，以根據(jù)載體序列設計的引物進行PCR擴增鑒定，四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA序列驗證引物：upper 5'-ACAAGGAAACTCGCTCAAA-3'，down 5'-GGCATAGAATCGGTGGTAG-3'。乙肝病毒X基因重組慢病毒質(zhì)粒的序列驗證引物：upper 5'-TAGTGAACCGTCAGATCG-3'，down 5'-CAGACTGCCTTGGGAAAA-3'。反應條件：94℃ 3min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35 個循環(huán)；72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 反向PCR鑒定HBx基因及調(diào)控基因的整合 我們選用EcoR I酶對細胞基因組進行酶解，pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced質(zhì)粒均含有EcoR I的酶切位點，分別在靠近慢病毒質(zhì)粒的5' LTR區(qū)和靠近EcoR I區(qū)分別設計兩對上下游引物。pLVX-Tight-Puro-HBx第一對引物：pEH125：5'-TGTACTAGGAGGCTGTAGG-3'；pEH119：5'-GATCTTTGTACTAGGAGGCT-3'。pLVX-Tet-On-Advanced第一對引物：ToE112：5'-ATGCCCTTGACGACTTTG-3'；ToE41：5'-ACAGCTAAAGTGCGAAAG-3'。pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced第二對 引 物 ：pEH232：5'-TTGTCTTCTTTGGGAGTG-3'；pEH287：5'-TCTGCTAATCAGGGAAGTA-3'。

選用EcoR I酶對細胞基因組總DNA充分酶解，50μL酶切體系中含有1μg基因組和5 U限制性內(nèi)切酶，37℃酶切5h。酶切片段純化后，溶于30μL 無菌水中。將 30μL 溶解產(chǎn)品于 400μL 自連接體系中16℃連接過夜。連接產(chǎn)品經(jīng)純化后溶于30μL無菌水中。半巢式PCR一擴的PCR引物分別為pEH125/pEH119，ToE112/ToE41，PCR二擴的引物為pEH232/pEH287。PCR反應條件為：94℃ 5min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 60s，35 個循環(huán) ；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組質(zhì)粒后測序克隆片段。

1.2.6 HBx基因可誘導表達的鑒定 將篩選穩(wěn)定的HepG2-HBx（reg）細胞均分為兩份，一份加Dox（1.0mg/mL）誘導培養(yǎng)，一份不加Dox（0mg/mL）培養(yǎng)，48h后收集細胞。

1.2.6.1 RT-PCR鑒定RNA的表達 提取細胞總RNA，DNase I處理后，逆轉錄為cDNA，以HBx基因的特異性引物進行PCR鑒定，引物為最初基因擴增的引物，程序同DNA鑒定。β-actin內(nèi)參引物序列：F1379：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'；R1663：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.2.6.2 Western blot鑒定HBx蛋白的表達 利用RIPA蛋白抽提液提取細胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)過SDSPAGE電泳后，恒流300mA 1h電轉移到硝酸纖維素膜上，轉膜封閉后，依次加入鼠抗HBxAg單抗，HRP標記抗IgG多抗孵育，NBT/BCIP 底物顯色，觀察蛋白的表達情況。

1.2.7 細胞免疫熒光試驗 將篩選穩(wěn)定的HepG2-HBx（reg）細胞以105接種于12孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細胞分為4組，每組3個重復孔，分組情況如下：

自發(fā)熒光對照組：不加一抗和二抗（都用含1％BSA的PBS代替）；空白對照組：不加一抗（用含1％ BSA的PBS代替），直接加二抗；未誘導試驗組：未加Dox（0mg/mL），加一抗，加二抗；誘導試驗組：加Dox（1.0mg/mL），加一抗，加二抗。

待細胞已基本鋪滿蓋玻片時，用不完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后進行細胞免疫熒光試驗，以排除小牛血清中蛋白對試驗的影響。

將細胞用預冷的丙酮室溫固定于細胞板中，封閉2h后，在細胞孔內(nèi)滴入鼠抗HBxAg單抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，隨后加入FITC標記的羊抗鼠IgG多抗室溫孵育30min，洗凈后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況。

2 結果

2.1 PCR擴增HBx基因片段

HBx基因大小為465bp，PCR擴增HBx基因產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結果（圖1）顯示，其基因片段大小與預期的相符，表明已成功獲取HBx基因片段。

圖1 PCR擴增X基因片段

重組質(zhì)粒pLVX-Tight-Puro-HBx經(jīng)PCR擴增驗證，擴增的條帶大小相符；經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I和EcoR I雙酶切驗證，酶切條帶與目的基因大小相符（圖 2）。

圖2 pLVX-X基因重組質(zhì)粒PCR及酶切

2.2 慢病毒的制備和滴度測定

細胞轉染后48h收集上清獲得重組病毒顆粒，經(jīng)病毒滴度試劑盒檢測，包裝出的病毒滴度約在108LPs/mL左右。

2.3 穩(wěn)定轉染的細胞系HepG2-HBx（reg）的構建與鑒定

含有四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA和HBx基因的重組病毒顆粒先后感染細胞，分別用600μg/mL濃度的G418和1.0μg/mL濃度的Puromycin篩選細胞，獲得穩(wěn)定細胞株HepG2-HBx（reg）。PCR擴增鑒定結果如圖3所示，證明了HepG2-HBx（reg）細胞中同時含有四環(huán)素調(diào)控元件和乙肝病毒X基因。

圖3 HepG2-HBx（reg）細胞PCR鑒定

2.4 反向PCR鑒定HBx基因的整合

應用反向PCR對于慢病毒載體介導基因的整合進行了驗證，二輪PCR鑒定結果如圖4及圖5所示。對上述挑取的克隆進行測序分析，通過對插入位點旁側序列的比對分析，其序列確是人類基因組中序列，分布于不同染色體中。pLVX-Tight-Puro-HBx反向轉化子共挑取10個克隆進行測序，測序結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)了7個插入位點（表1）；pLVX-Tet-On-Advanced反向轉化子共挑取8個克隆進行測序，經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)了4個插入位點（表2）。證明慢病毒感染HepG2細胞后目的基因的確整合于細胞基因組中。

2.5 HepG2-HBx（reg）細胞中X基因可誘導表達的鑒定

RT-PCR結果（圖4）顯示，加入Dox誘導的細胞中檢測到X基因的RNA表達，而沒有加入Dox（0mg/mL）的細胞中則檢測不到X基因的RNA表達。Western blot試驗結果顯示同上，加入Dox（1.0mg/mL）誘導的細胞中檢測到X基因的蛋白表達，而未加入Dox的細胞中則檢測不到X基因的蛋白表達（圖5），HBV X蛋白大小約為17kD，內(nèi)參β-actin蛋白檢測條帶大小約為42kD，試驗結果與理論值基本相符，說明可誘導表達細胞試驗模型構建成功。

表1 pLVX-Tight-Puro-HBx反向轉化子整合位點旁側序列分析

表2 pLVX-Tet-On-Advanced反向轉化子整合位點旁側序列分析

圖4 HepG2-HBx（reg）細胞RT-PCR誘導表達驗證

2.6 HepG2-HBx（reg）細胞免疫熒光試驗

在放大400倍（目鏡10×物鏡40）的熒光顯微鏡下觀察，細胞免疫熒光試驗結果（圖6）顯示，

圖5 HepG2-HBx（reg）細胞Western blot誘導表達驗證

3 討論

針對病毒性肝炎的研究，抗病毒藥物的開發(fā)和評價中的重要環(huán)節(jié)之一就是建立一種方便有效，且與人類天然感染近似的試驗模型。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，有關HBV的細胞和動物模型相繼建立。現(xiàn)有HBV體外感染的細胞模型主要包括人原代肝細胞（primaryhumanhepatocytes，PHH）、HepRG細胞和HepG2.2.15細胞等［9-11］，但其均有各自的缺陷。PHH細胞的分離和體外培養(yǎng)較困難；HepRG細胞培養(yǎng)需DMSO化學誘導，可能對HBV感染和表達過程有所影響［11，12］；HepG2.2.15細胞是目前應用較為廣泛的細胞模型，但由于其HBV DNA已穩(wěn)定地整合入肝細胞的基因組，無法模擬HBV天然的感染過程［6］。目前，在實驗室中構建的多數(shù)HBx研究模型，是在外源強啟動子（如CMV啟動子）控制下穩(wěn)定的表達，以非整合病毒來源的載體為工具研究其在誘發(fā)肝炎和肝癌形成中的作用，而這并不理想［13］。

慢病毒具有可以有效地整合入宿主細胞并穩(wěn)加入Dox（1.0mg/mL）誘導的細胞于熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，而沒有加入Dox（0mg/mL）的細胞中則沒有觀測到綠色熒光。再次證明可誘導表達細胞試驗模型的構建成功。

圖6 HepG2-HBx（reg）細胞免疫熒光試驗

上述多種試驗方法的結果說明了HBx基因在細胞中實現(xiàn)了蛋白表達的可調(diào)控性，將為開展乙肝病毒持續(xù)感染和致病的研究，以及抗HBV藥物的篩選提供較為理想的試驗模型。定表達外源基因的優(yōu)勢，并不易誘發(fā)免疫反應，適用于體內(nèi)基因治療，是一種較為理想的基因轉移載體［14］。本試驗利用已廣泛運用的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)，應用慢病毒感染的途徑成功構建了乙肝病毒X基因的可調(diào)控表達細胞模型，應用多種方法鑒定了HBx基因的誘導表達，實現(xiàn)蛋白表達的可調(diào)控性。

實驗室同時構建了HBV其他基因的可調(diào)控細胞模型，擬在細胞模型的基礎上，通過人為控制蛋白的表達來觀察HBV蛋白表達前后細胞內(nèi)的整體變化趨勢，更全面系統(tǒng)地研究HBV對宿主的影響。隨后，我們擬通過芯片和蛋白質(zhì)組學等方法分析這些病毒組分感染宿主的過程中對宿主的MicroRNA及蛋白質(zhì)組的影響，特別是一些機體免疫和腫瘤發(fā)生相關分子的變化，進一步對其在宿主內(nèi)改變表觀遺傳修飾及形成免疫耐受的作用機理進行深入研究。

4 結論

本研究應用四環(huán)素Tet-On調(diào)控系統(tǒng)構建了乙肝病毒X基因的誘導表達載體，經(jīng)HEK 293T細胞包裝獲得含有調(diào)控元件rt-TA和HBx基因的病毒顆粒，P24法測定滴度達到108LPs/mL。將兩種病毒先后感染HepG2細胞系，經(jīng)G418和Puromycin抗生素篩選獲得整合有HBx基因的穩(wěn)定細胞株HepG2-HBx（reg），并應用RT-PCR和Western blot等方法驗證了HBx基因的可誘導表達。該細胞模型的成功構建為研究HBx基因在對宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了一種較理想的試驗模型。

致謝：本實驗室博士研究生湯必奎和碩士研究生孫勇曾對本課題的研究和部分試驗內(nèi)容給予幫助，在此由衷的表示感謝。

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