齊元富 李慧杰 李 靜

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南，250011;2山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南，250355)

Folkman早在1971年就提出了腫瘤發(fā)生發(fā)展具有血管依賴性的觀點(diǎn)，研究腫瘤血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制一度成為關(guān)注的焦點(diǎn)，而以抑制腫瘤血管生成為靶點(diǎn)阻斷腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移成為腫瘤防治的重要途徑［1］。傳統(tǒng)中成藥六神丸作為中醫(yī)學(xué)“攻毒治法”的代表方劑，其抗腫瘤的作用日益受到重視。本研究意在探討六神丸對(duì)H22肝癌腹水移植瘤PDGF與VEGF表達(dá)的影響及其可能機(jī)制，以期為中醫(yī)藥抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 H22肝癌荷瘤小鼠(腹水型)，昆明小鼠，購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 主要藥品及試劑 六神丸(蘇州雷允上制藥生產(chǎn)，批號(hào) HA1001)，順鉑(齊魯制藥生產(chǎn)，批號(hào)04090291)。兔抗鼠VEGF多克隆抗體試劑盒(編號(hào)SA2252)，兔抗鼠PDGF單克隆抗體(編號(hào)BA1498)，SABC免疫組化試劑盒(兔IgG 1/2KIT，編號(hào)SA1065)，二氧基聯(lián)苯胺濃縮顯色液(編號(hào)AR1065)，均為博士德公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 高清晰度HP2AS－1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

1.4 H22肝癌腹水移植瘤模型的建立 脫頸椎處死接種傳代7d的H22肝癌荷瘤小鼠，無菌條件下取腹水于容器冰塊保存。并留取部分腹水觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)，滴腹水于玻片涂片，瑞氏染色，鏡下細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，其中瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)≥95%，并取0.9mL加0.1mL臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞總數(shù)及死細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞記數(shù)＞95%。將肝素管內(nèi)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL備用，取昆明小鼠每只于右腋窩皮下接種0.2mL備用細(xì)胞液建立移植瘤模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將40只成功接種24 h后的移植瘤模型小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，開始給藥。1)對(duì)照組:灌服生理鹽水，0.4mL/只，1次/d;2)六神丸組:灌服濃度為7.5mg/mL的六神丸溶液，0.4mL/只，1次/d;3)順鉑組:腹腔注射濃度為0.1mg/mL的順鉑，0.2mL/只，1次/2日，共2次;4)聯(lián)合組(六神丸 +順鉑):2)+3)。用藥10天，末次給藥后1h處死小鼠，剝?nèi)×鲶w組織。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法 瘤體組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定48h，常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋，每一組織塊連續(xù)4μm切片4張。免疫組化方法采用SABC法染色，脫蠟至水化的切片經(jīng)微波熱抗原修復(fù)，血清封閉，按組別加兔抗鼠VEGF多克隆抗體或兔抗鼠PDGF單克隆抗體，并設(shè)立陰性對(duì)照(以PBS緩沖液替代一抗)，DAB染色，具體按試劑盒說明逐步操作。顯微鏡下觀察PDGF與VEGF表達(dá)情況，高清晰度HP2AS－1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度和強(qiáng)度測(cè)定，經(jīng)分析軟件掃描統(tǒng)計(jì)其平均灰度值和平均面密度陽性率，平均面密度陽性率=陽性目標(biāo)面密度/(陽性+陰性目標(biāo)面密度)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所獲數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0上運(yùn)行處理，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 腫瘤組織血小板源生長(zhǎng)因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)表達(dá)情況 細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色代表PDGF陽性染色。鏡下觀察:對(duì)照組中可見腫瘤組織及其間質(zhì)中有大量呈片狀或團(tuán)塊狀分布的棕黃色顆粒，陽性染色以對(duì)照組最明顯，而各藥組陽性表達(dá)相對(duì)較少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:對(duì)照組移植瘤組織中PDGF表達(dá)平均灰度值較高，六神丸組、順鉑組及聯(lián)合組平均灰度值均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，其中，聯(lián)合組灰度值最低，抑制作用最明顯;而與順鉑組比，聯(lián)合組亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);對(duì)照組移植瘤組織中PDGF平均面密度陽性率最高，六神丸組、順鉑組及聯(lián)合組均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，以聯(lián)合組最低;而與順鉑組比，聯(lián)合組亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);說明六神丸與順鉑聯(lián)用，抑制PDGF表達(dá)作用更加顯著，見表1。

表1 H22肝癌腹水移植瘤組織PDGF表達(dá)情況

2.2 腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)表達(dá)情況 腫瘤細(xì)胞及其附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒代表VEGF染色為陽性表達(dá)。鏡下可見，對(duì)照組腫瘤組織及其間質(zhì)中有大量呈片狀或團(tuán)塊狀分布的棕黃色顆粒，陽性染色以對(duì)照組最明顯，而各藥組陽性表達(dá)相對(duì)較少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:對(duì)照組移植瘤組織中VEGF表達(dá)平均灰度最高，六神丸組、順鉑組及聯(lián)合組平均灰度值均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，以聯(lián)合組抑制作用最明顯;而與順鉑組比，聯(lián)合組亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);移植瘤及其間質(zhì)中VEGF表達(dá)對(duì)照組平均面密度陽性率最高，六神丸組、順鉑組及聯(lián)合組均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，且以聯(lián)合組最明顯;而與順鉑組比，聯(lián)合組亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);說明六神丸與順鉑聯(lián)用，抑制VEGF表達(dá)作用更加顯著，見表2。

表2 H22肝癌腹水移植瘤組織VEGF表達(dá)情況

3 討論

惡性腫瘤是當(dāng)今全球突出的公共衛(wèi)生問題，目前已成為威脅人類健康的最嚴(yán)重疾病之一，近10年來，其總體發(fā)病情況在世界各國(guó)呈上升趨勢(shì)，防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻［2］?；谘苌煽纱龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，以抗腫瘤血管生成達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移為目的成為治療腫瘤的有效策略，而血管生成抑制物多通過直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、阻斷血管生成因子，抑制基質(zhì)反應(yīng)或降解等幾個(gè)環(huán)節(jié)達(dá)到抑制作用［3］。在眾多與血管有關(guān)的因子中，VEGF是迄今鑒定出來的最重要的血管生成因子，其可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)血管新生，在病理生理性血管生長(zhǎng)過程中起關(guān)鍵作用，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［4］。PDGF是重要的血管生長(zhǎng)因子及強(qiáng)有力的促細(xì)胞分裂原，研究發(fā)現(xiàn)其參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。腫瘤細(xì)胞釋放PDGF不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞遷移及刺激細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤血管發(fā)生起著直接的作用，還可通過上調(diào)VEGF表達(dá)水平間接誘導(dǎo)血管生成，即腫瘤中PDGF可通過自分泌和旁分泌信號(hào)途徑加速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及刺激血管再生［6］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤防治中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)一些中藥的有效成分及復(fù)方有明顯的抗新生血管作用，在抑制腫瘤血管生成中具有良好的應(yīng)用前景。而六神丸是攻毒治法的代表方劑，其抗腫瘤作用一方面可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，另一方面可通過提高機(jī)體免疫力、利用自身防御機(jī)能間接殺傷腫瘤細(xì)胞［7］。

前期工作中初步研究表明六神丸對(duì)腫瘤血管形成有明顯抑制作用［8］，為進(jìn)一步探討其機(jī)制，本研究采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，在建立H22肝癌腹水移植瘤模型的基礎(chǔ)上分組給藥干預(yù)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法測(cè)定PDGF與VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:移植瘤中六神丸組、順鉑組及聯(lián)合組的PDGF及VEGF表達(dá)平均灰度值及面密度陽性率均顯著低于對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性意義，且聯(lián)合組灰度值最低、優(yōu)于六神丸及順鉑單用，抑制作用最明顯，提示六神丸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同作用。進(jìn)一步證實(shí)，六神丸抗腫瘤血管生成的機(jī)理與其抑制PDGF與VEGF表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

［1］張春麗.中藥對(duì)腫瘤血管生成抑制作用的研究［J］.北京中醫(yī)藥，2011，30(2):156 －160.

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