肖麗恒，何學(xué)梅，李 萍，謝啟明

(1.楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 楚雄 675000;2.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000)

黃曲霉毒素 (aflatoxin，簡(jiǎn)稱為AF)是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)均為二氫呋喃香豆素的衍生物，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，食用這些被污染的食物，直接影響人們的身體健康和生命安全。為了保證人身安全，國(guó)家規(guī)定的食品中允許含量極低［1］。

黃曲霉毒素的檢測(cè)分析方法有薄層色譜法 (TLC)［2］、高效液相色譜法 (HPLC)［3—6］、氣相色譜法 (GC)［2］、酶聯(lián)免疫法 (ELISA)、放射免疫檢測(cè)法［8］、以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法［9—13］，目前檢測(cè)黃曲霉毒素的方法比較廣泛的為免疫親和層析凈化高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法這兩種方法。TLC所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，干擾因素多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度的目測(cè)準(zhǔn)確性比較差，主要是半定量;放射免疫法的樣品前處理提取方法簡(jiǎn)便，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，只能應(yīng)用于初篩分析［8］。目前的國(guó)標(biāo)方法為免疫親和柱—液相色譜法，該方法靈敏度高，特異性好，但是存在免疫親和柱價(jià)格昂貴，需低溫保存，保存期短等缺點(diǎn)［9］。ELISA方法雖操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，但有靈敏度較低、重復(fù)性較差、試劑壽命短、需要低溫保存等缺點(diǎn)［14］。因此，本文選擇乙腈提取，固相萃取純化作為前處理手段，UPLC－MS/MS檢測(cè)法作為檢測(cè)技術(shù)，建立了一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、分析速度快、適用于食品中黃曲霉毒素檢測(cè)的檢測(cè)方法。

1.材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

安捷倫高壓液相色譜儀 (型號(hào):1260)，系統(tǒng)配制:泵 (型號(hào):G1312C)，電噴霧串聯(lián)雙重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器 (型號(hào):6460)、自動(dòng)進(jìn)樣器 (型號(hào):G1367E)、恒溫柱溫箱 (型號(hào):G1316A)、真空在線脫氣機(jī) (型號(hào):G1322A)、化學(xué)工作站 (型號(hào):MassHunterQQQ)、樣品均質(zhì)器、漩渦混合器 (或高速攪拌器)、高速離心機(jī)、氮?dú)獯蹈蓛x、超聲波清洗器、移液器、真空抽濾泵、EasyDI8超純水機(jī)。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 (10 μg/ml)、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 (10 μg/ml)、乙腈(色譜純)、甲醇 (色譜純)、甲酸 (色譜純)、乙酸 (色譜純)、甲酸銨 (色譜純)、乙酸銨 (色譜純)、氯化鈉 (分析純)、石油醚 (分析純)、三氯甲烷 (分析純)。次氯酸鈉溶液 (50 g/L)，SPE柱(ProElut AFT 1500 mg/12 mL)、0.45μm濾膜、一次性注射器。

1.3 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Ecipse XDB－C18柱 (柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑3.0 mm，填料直徑1.8 μm)，流動(dòng)相:甲醇+0.1%甲酸水溶液 (60∶40);進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.4 mL/min，柱溫:45.0℃。

1.4 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧電離正離子模式 (ESI+);毛細(xì)管電壓為3.0kV(ESI+);去溶劑氣溫度為300℃;氮?dú)饬魉贋?0 L/min;碰撞氣壓力為40psi;掃描范圍為50～400 m/z，光電倍增器電壓增值為300 V;質(zhì)譜掃描模式為MRM模式。黃曲霉毒素的質(zhì)譜條件如表1。

表1 黃曲霉毒素M1、B1檢測(cè)的質(zhì)譜條件

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取試樣2 g于50 mL離心管中，固體樣品加入5 mL水，非固體樣品不用加水，靜置10 min，加入20 mL乙腈，旋渦混合2 min，超聲提取20 min，加入飽和的氯化鈉溶液10 mL或者加入5 g氯化鈉，旋渦混合1 min，4000 rpm離心10 min，取出上清液，再加10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次的上清液于試管中，在氮吹儀上45℃吹至近干，用2 mL乙腈溶解并旋渦混合1 min，等待凈化。

1.5.2 樣品凈化

用乙腈活化SPE小柱10 min。將待凈化液加入小柱，加2 mL乙腈潤(rùn)洗試管，洗液加入小柱一起凈化處理，接收流出液。用20 mL乙腈洗脫，流速控制在1mL/min，洗脫液在45℃水浴中氮吹吹干，用精密移液器取1 mL流動(dòng)相溶解，旋渦混合1 min，過(guò)0.45 μm的有機(jī)系濾膜，5 μL進(jìn)樣上機(jī)檢測(cè)。

2.結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了提高檢測(cè)器的靈敏度和使用性能，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器的使用參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，條件如1.4的設(shè)定，待儀器穩(wěn)定后，采用電噴霧電離正離子模式 (ESI+)MS1全掃描，掃描范圍為50～400(M/Z)，選出黃曲霉毒素M1和B1的母離子和優(yōu)化電離電壓，在對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離并優(yōu)化碰撞能量，得出的參數(shù)如表1。

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)時(shí)選用甲醇和水作為流動(dòng)相，出峰時(shí)間好。但是為了更好地離子化，就在水溶液中加入甲酸，使甲酸的含量為0.1%。當(dāng)甲醇和0.1%甲酸水溶液的比例為60:40(體積比，V/V)時(shí)，等度洗脫，黃曲霉毒素M1出峰時(shí)間為1.555 min，黃曲霉毒素B1出峰時(shí)間為2.104 min，分離效果較好，出峰時(shí)間比較合理，標(biāo)樣含量為1.0 μg/L色譜圖如下圖1。

圖1 黃曲霉毒素M1、B1標(biāo)樣色譜圖

2.2 萃取方式的選擇

黃曲霉毒素易溶于油、甲醇、乙腈、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚，己烷和乙醚中。利用甲醇和水作為樣品提取溶劑，在使用氯仿進(jìn)一步提取，操作步驟多，使得回收率的測(cè)定結(jié)果偏低。于是選擇加適量的水和乙腈作為提取溶劑，在漩渦混合使其充分混合，采用超聲波超聲提取20 min，4000 rpm離心10 min，能夠充分的提取黃曲霉毒素，加入5 g氯化鈉，能很好的使乙腈和水相進(jìn)行分離，上清液乙腈也有利于氮吹濃縮。

2.3 純化方法的優(yōu)化

黃曲霉毒素的凈化方法目前主要使用免疫親和柱 (IAC)進(jìn)行凈化，其特點(diǎn)是將特異性的黃曲霉毒素單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)并填柱而成。由于抗原抗體有一一對(duì)應(yīng)的特異性吸附關(guān)系，所以免疫親和柱 (IAC)只能特效性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素，而不讓其他雜質(zhì)通過(guò)柱子，使樣品得以純化。這種吸附又可以被極性有機(jī)溶劑洗脫，進(jìn)行定量檢測(cè)，但是免疫親和柱存在價(jià)格昂貴，只能使用一次，需低溫保存，保存期短等缺點(diǎn)［9］。

另外，使用乙醚或者石油醚除脂，甲醇和水溶液提取，再用氯仿純化，方法雖然簡(jiǎn)單，但是純化不完全，而且質(zhì)譜所用的色譜柱填料細(xì)，容易堵塞色譜柱和污染檢測(cè)器。使用固相萃取柱 (SPE)進(jìn)行分離純化，其特點(diǎn)是它以極性、非極性及離子交換等幾類基團(tuán)組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，黃曲霉毒素不被吸附而直接通過(guò)，從而達(dá)到凈化目的，并且價(jià)格合適，于是選用SPE柱進(jìn)行凈化。

2.4 校準(zhǔn)曲線和檢出限

將黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液按一定的濃度比例進(jìn)行逐級(jí)稀釋，并配置成質(zhì)量濃度為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，在設(shè)定好的檢測(cè)條件下，以峰面積和質(zhì)量濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃曲霉毒素M1在1μg/L～50 μg/L線性關(guān)系良好，黃曲霉毒素B1在1 μg/L～10 μg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，線性回歸方程和檢出限如表2。

表2 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.5 樣品添加回收試驗(yàn)和精密度

準(zhǔn)確稱取2 g固體檢測(cè)樣品或5 g液體樣品，進(jìn)行空白和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)物的含量為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取和凈化，制得加樣回收率供試品溶液進(jìn)行UPLC－MS/MS檢測(cè)分析。并計(jì)算出回收率好和相應(yīng)RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明，此方法回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，滿足實(shí)驗(yàn)方法要求。

表3 樣品中黃曲霉毒素添加回收率和精密度 (n=5)

3.結(jié)論

建立固相萃取與UPLC－MS/MS檢測(cè)食品中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素B1的方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、分析速度快，滿足食品中黃曲霉毒素檢測(cè)的檢測(cè)方法。

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