肖瑞雪 農(nóng)蔚霞 宋 瓊 陳 芳 何少健

廣西醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，廣西南寧 530021

癌-睪丸抗原（cancer-testisantigen，CTA）是一類限制性表達(dá)于正常睪丸和腫瘤的抗原，它曾被認(rèn)為與癌的發(fā)生有關(guān)。近幾年來，CTA 被看作是癌癥免疫療法的理想靶點(diǎn)而倍受關(guān)注[1]。CTA的編碼基因通過誘導(dǎo)人體的免疫細(xì)胞引起特殊的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。已有報(bào)道指出，CTA 家族中某些基因已經(jīng)用于腫瘤的分子診斷和免疫治療[2]。

滑膜肉瘤X 斷裂點(diǎn)基因 （synovial sarcoma，X breakpoint gene），又稱SSX 基因，是多個(gè)成員的基因家族，它們均位于X 染色體p11.23～p11.22 位，作為CTA 家族成員之一，其只在睪丸、胎盤等具有血液屏障的正常組織中表達(dá)。對(duì)SSX 基因序列和功能研究發(fā)現(xiàn)，SSX 基因表達(dá)產(chǎn)物的主要功能為轉(zhuǎn)錄抑制。SSX 基因編碼的蛋白有兩個(gè)功能區(qū)：SSX-KRAB 區(qū)（SSX-related kruppel associated box domain）和 SSX-RD 區(qū)（SSX-repression domain）[3]，而 SSX-KRAB 區(qū)的結(jié)構(gòu)域所編碼的蛋白又隸屬于KRAB-鋅指蛋白亞群但其抑制轉(zhuǎn)錄的功能微弱，甚至是無效的；另一功能區(qū)SSXRD 功能發(fā)揮是通過對(duì)核內(nèi)染色質(zhì)進(jìn)行修飾而達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄作用[4]。

Tureci 等[5]在325 份不同組織來源的腫瘤樣品中分析SSX1-5 基因家族mRNA的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，除SSX-3 以外其余4 種基因至少有一種基因在腫瘤樣品中有表達(dá)。Ayyoub 等[6]對(duì)6 種不同組織類型的10個(gè)滑膜肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行SSX1～5 基因mRNA 表達(dá)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兩種以上基因同時(shí)表達(dá)的占60%，全部腫瘤細(xì)胞至少表達(dá)一種上述基因。Naka 等[7]在研究骨肉瘤SSX 基因表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，17個(gè)患者標(biāo)本中有16個(gè)患者的標(biāo)本至少表達(dá)SSX1～5 基因中的一種。綜合上述，SSX 基因家族在腫瘤患者中mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，整個(gè)SSX 基因家族在癌組織中處在相對(duì)較高的表達(dá)頻率，而且也存在基因共同表達(dá)情況。因此，研究針對(duì)SSX 基因家族不同成員均有作用的抗原表位，勢(shì)必可以提高基于SSX 基因家族腫瘤免疫治療的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用RT-PCR 方法，針對(duì)肝癌組織和肝癌細(xì)胞株中SSX 基因家族mRNA 表達(dá)和共表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，為基于SSX 基因家族的腫瘤免疫治療和多價(jià)疫苗的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞株Bel-7404 購(gòu)自上海細(xì)胞所，肝癌細(xì)胞株HePG2 由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)專業(yè)宋德志老師惠贈(zèng)，肝癌細(xì)胞株7721 來自廣西醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代，正常細(xì)胞株（陰性對(duì)照）7702 由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心蔡新老師惠贈(zèng)。

收集2009年2月～2010年10月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科和肝移植科住院患者的外科手術(shù)切取組織。組織標(biāo)本包括28例肝細(xì)胞癌及癌旁組織，3例肝硬化組織。標(biāo)本的臨床分期依據(jù)1977年全國(guó)肝癌防治協(xié)作會(huì)議TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。28例肝癌組織中包括11例結(jié)節(jié)型肝癌，13例巨塊型肝癌，4例彌漫型肝癌，其中14例處于TNM分期的Ⅰ～Ⅲ期，14例處于Ⅳ期?；颊吣挲g22～86歲，平均50歲，其中，男24例，女4例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI 1640 培養(yǎng)基 （包括10%胎牛血清，100 μ/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素）于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA 提取將手術(shù)后切取的肝癌組織和癌旁組織迅速放入液氮中，然后盡快轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi)。用Trizol試劑（上海寶生物公司）提取組織和細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值，1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)RNA完整性。取500 ng 總RNA，用RT-PCR 試劑盒DRR019A（TAKARA公司）合成cDNA，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系參考試劑盒說明書。

1.2.3 半定量 RT-PCR 檢測(cè) SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA表達(dá) 采用RT-PCR 法檢測(cè)SSX1、SSX-2、SSX-3 mRNA 表達(dá)。所用引物及擴(kuò)增片段如下，SSX-1（422 bp）上游引物：5'-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC-3'，下游引物：5'-AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA-3'；SSX-2 （435bp）上游引物：5'-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3'，下游引 物 ：5'-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3'；SSX-3 （378 bp）上游引物：5'-GGAAGAGTG GGAAAAGATGAAAGT-3'，下游引物：5'-CCCCTTTTG GGTCCAGATATCA-3'；內(nèi)參p53（763 bp）上游引物：5'-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3'， 下游引物：5'-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3'。PCR 反應(yīng)條件：SSX-1 為56℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；SSX-2 為 54℃退火 30 s，擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)；SSX-3 為61℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；內(nèi)參p53 為65℃退火40 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。隨機(jī)選取每個(gè)基因中6個(gè)陽(yáng)性表達(dá)的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 序列測(cè)定。PCR 引物的合成由上海捷瑞公司進(jìn)行，產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定由北京諾賽公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 測(cè)序結(jié)果

隨機(jī)抽取的陽(yáng)性表達(dá)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測(cè)序，所得序列與基因庫(kù)檢索序列一致，證實(shí)所擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基因的片段。

2.2 SSX mRNA 在肝癌細(xì)胞株的表達(dá)

在肝癌細(xì)胞株 7404、HePG2、7721 中，SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA的表達(dá)不同，但是在每一種細(xì)胞株中至少有一種基因表達(dá)。 在 7404（圖 1）中，有 SSX-1（422 bp）和SSX-3（378 bp）表達(dá)；在 HePG2（圖 2）中，有 SSX-2（435bp）和 SSX-3（378 bp）表達(dá)；在 7721（圖 3）中，只有 SSX-3（378 bp）表達(dá)。 p53（763bp）作為內(nèi)參，均有表達(dá)。

2.3 SSX mRNA 在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

SSX 基因在癌旁組織和肝硬化組織中均不表達(dá)。在肝癌組織中，SSX-1、SSX-2、SSX-3的表達(dá)陽(yáng)性率分別為53.6%、35.7%、57.1%。 p53（763 bp）作為內(nèi)參，均有表達(dá)。 見圖4。

2.4 SSX 表達(dá)率與肝癌臨床指標(biāo)的關(guān)系

SSX mRNA 表達(dá)與肝癌患者的性別、年齡、HBV、AFP、病理分型、TNM分期、門靜脈癌栓和肝硬化發(fā)生與否無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 SSX表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系[n（%），n=28]

2.5 3 種SSX 基因共同表達(dá)情況

28例肝癌組織中，6例（21.4%）標(biāo)本3 種SSX 基因均有表達(dá)，23例（82.1%）標(biāo)本至少表達(dá)兩種SSX 基因。

3 討論

本研究課題所收集的肝細(xì)胞癌組織中SSX-1、SSX-3基因表達(dá)陽(yáng)性率較高 （53.6%、57.1%），SSX-2 表達(dá)陽(yáng)性率相對(duì)較低（35.7%）。這與以往研究所證實(shí)的SSX 基因家族在肝癌中有較高表達(dá)相一致[8-10]，其高表達(dá)的特性（表達(dá)率大于50%）提示該基因家族可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究28例肝癌組織中，6例（21.4%）標(biāo)本3 種SSX基因均有表達(dá)，23例 （82.1%）標(biāo)本至少表達(dá)兩種SSX 基因；離體培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株7404、HePG2、7721 中SSX1～3基因的表達(dá)雖各不相同，但至少有一種基因表達(dá)，同時(shí)也存在基因的共表達(dá)。這3 種基因同時(shí)表達(dá)為采用多價(jià)疫苗進(jìn)行肝癌的免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，本研究課題在癌旁組織和正常肝細(xì)胞株中沒有檢測(cè)到SSX 基因的表達(dá)，與Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)在肝癌的少數(shù)癌旁組織中有微弱的SSX 基因表達(dá)不相符，原因可能與樣本量較少有關(guān)，可擴(kuò)大樣本量后再深入研究驗(yàn)證。SSX 基因在肝癌中高頻率表達(dá)，而在非癌中不表達(dá)，又為肝癌特異性免疫治療提供了潛在靶位。

目前對(duì)于肝癌的診斷仍以AFP的檢測(cè)和影像學(xué)檢查為主，這兩種方法都可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，所以尋找一種特異性更高的診斷方法成為臨床上的迫切所需。本研究結(jié)果與肝癌臨床指標(biāo)結(jié)合后發(fā)現(xiàn)：SSX1～3 基因表達(dá)與年齡、性別、病理分型、TNM分期、HBV、血清AFP 水平、門脈癌栓、肝硬化無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。而研究結(jié)果又顯示：相當(dāng)一部分AFP 正常（≤ 20 μg/L）肝癌患者存在SSX基因表達(dá)，提示可以將SSX1～3 基因mRNA 作為腫瘤標(biāo)志物，用于肝癌的輔助診斷。

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