陳 昊 喬麗旻 周 超▲

1.上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201318；2.聯(lián)洋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心內(nèi)科，上海 200135

雖然目前對于皮質(zhì)類固醇激素的臨床使用尚有爭議，2008拯救敗血癥患者運動（SSC）指南仍建議膿毒癥休克持續(xù)低血壓的情況下，若使用液體復(fù)蘇以及升壓藥物無效時使用皮質(zhì)類固醇激素[1]。地塞米松（Dexamethasone，DEX）作為臨床上常用的皮質(zhì)酮激素（glucocorticoid，GC），在臨床上已進行廣泛的應(yīng)用。并有大量的文獻表明小劑量的使用激素可以對膿毒癥預(yù)后有一定改善[2-3]。本研究擬通過盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）手術(shù)建立膿毒癥大鼠模型后進行地塞米松干預(yù)，來研究、觀察地塞米松對金屬基質(zhì)蛋白酶-9（MMP-9）和腫瘤環(huán)死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的影響及對生存率的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠78只，體重235～260 g，SPF級大鼠，實驗大鼠均購自第二軍學(xué)動物實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及常規(guī)處理

78只SD大鼠完全隨機分為CLP手術(shù)組、地塞米松治療組（DEX），每組各 36只，組內(nèi)分 12 h組（共 6只）、24 h組（共 10只）、48 h組（共 10只）、96 h組（共 10只）。各組分別在預(yù)定時間點處死存活的大鼠。DEX治療組在手術(shù)完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。假手術(shù)組（sham）共6只，打開腹腔后僅翻動腸道即關(guān)腹，不予手術(shù)處理。

1.2.2 建立重癥膿毒癥動物模型

1.2.2.1 購入動物后進行適應(yīng)飼養(yǎng)1周，開始實驗前禁食12 h。按照40 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥。注射麻醉后，將動物置于仰臥位固定于操作板上，腹部手術(shù)區(qū)去毛后消毒后腹壁作長2 cm切口，切口進腹在分離回盲瓣末端并結(jié)扎盲腸，以針頭在結(jié)扎端處穿刺3次后擠出糞便，最后間斷縫合關(guān)腹，并在皮下注射生理鹽水100 mL/kg抗休克。實驗各分組在預(yù)定12、24、48 h時間點處死大鼠，處死后實驗對象并取標(biāo)本。假手術(shù)組僅開腹翻動腸道后縫合，不予手術(shù)處理。術(shù)后不予生理鹽水補液。假手術(shù)組建立10 min后立即予處死。

1.2.2.2 DEX治療組在手術(shù)完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。CLP組不進行任何干預(yù)治療。

1.3 評價指標(biāo)測定

1.3.1 生存率

記錄各實驗時間點大鼠的生存數(shù)目。

1.3.2 采集標(biāo)本

1.3.2.1 采集血清標(biāo)本：處死大鼠并取血置于離心管中，使用低溫離心機離心 30 min（2000 r／min），離心半徑 13.5 cm，取血清后立即凍存于-80℃冰箱中，待測定。

1.3.2.2 肺組織取材：處死實驗動物后開胸取肺，吸水紙吸取左肺表面液體，電子天平稱重后立即置于恒定90℃烤箱中烘干72 h后稱取干重，計算肺組織干/濕重比（W/D）。

1.3.3 血清炎癥因子的測定

采取雙抗體夾心ELISA法檢測血清炎癥因子MMP-9及 TNF-α、IL-6、白介素-8（IL-8）測定，試劑盒均購自上海西塘公司。嚴格按照試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物生存率記錄結(jié)果

地塞米松干預(yù)96 h后大鼠生存率有所改善，各組生存率見表1。經(jīng)χ2檢驗24、48 h組生存率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表1 實驗大鼠生存率情況

2.2 實驗動物W/D結(jié)果

CLP組的W/D水平在12 h出現(xiàn)下降，24 h組W/D水平仍進一步下降。48 h W/D水平開始上升。而在DEX組W/D水平同CLP變化類似，12 h組DEX干預(yù)后W/D低于CLP組（P＜0.05）。DEX干預(yù)組24 h組和48 h均高于CLP組。見表2。

2.3 實驗動物 TNF-α、IL-8、IL-6、MMP-9 血清水平表達結(jié)果

2.3.1 TNF-α

CLP術(shù)后TNF-α水平出現(xiàn)明顯上升，DEX組除12 h組外與同時間點CLP組比較均出現(xiàn)下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。 見表2。

2.3.2 IL-8

DEX組比CLP組同時間點有下降趨勢，DEX干預(yù)后除12 h外各時間點與對照組比較均出現(xiàn)下降。48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 結(jié)果比較（±s）

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 結(jié)果比較（±s）

注：與 CLP組同時間段比較，*P＜0.05；與 sham 組同時間段比較，#P＜0.05，##P＜0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MMP-9：金屬基質(zhì)蛋白酶 9；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8；W/D：肺組織干/濕重比；Sham：假手術(shù)組；DEX：地塞米松；CLP：盲腸結(jié)扎穿刺；“-”代表無數(shù)據(jù)

8.59±7.21 71.65±37.79 89.06±33.85 109.93±10.99-79.18±15.44 74.62±18.55 102.62±22.71 107.94±61.11 21.00±5.11 59.35±19.43 85.28±4.87 117.79±44.16-62.63±37.70 42.04±15.21#33.08±15.72##42.22±11.05 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）150.15±43.99 1665.12±256.45 2201.55±147.39 3582.41±2304.93-2108.11±745.38 2033.23±220.48 1576.75±534.40##2115.82±604.54 IL-8（ng/L）12.15±5.66 12.47±2.50 23.47±11.62 45.27±21.38-12.39±11.71 15.67±1.20 16.57±5.56##20.99±2.51 4.87±0.13 4.63±0.11 4.40±0.14 4.49±0.10-4.41±0.02*4.48±0.07 4.53±0.19 4.58±0.04 MMP9（ng/L） W/D sham組CLP組12 h組24 h組48 h組96 h組DEX組12 h組24 h組48 h組96 h組6 6630 6973組別 只數(shù)

2.3.3 IL-6

DEX組比CLP同時間點比較有下降趨勢，DEX干預(yù)后除12 h外各時間點與對照組比較均出現(xiàn)下降。24 h與對照組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3.4 MMP-9

DEX組比CLP組同時間點有下降趨勢，DEX干預(yù)后除12 h外各時間點與對照組比較均出現(xiàn)下降。48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

3 討論

膿毒癥目前已成為住院患者最主要的死亡原因之一[4]。地塞米松對炎癥及免疫反應(yīng)有強大的抑制效應(yīng)，正確使用可以有效地改善膿毒癥的預(yù)后。不同的用藥劑量以及時間對于激素使用的療效均有明顯的影響[5-6]。綜合既往的文獻報道，本實驗選擇在CLP手術(shù)后6 h皮下使用小劑量的地塞米松。敗血癥早期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，可以激活免疫細胞，防止中性粒細胞活化及內(nèi)皮細胞損害，減少花生四烯酸的釋放，抑制炎癥因子抗休克。減少前列腺素、氧自由基等炎癥介質(zhì)的釋放，在膿毒癥時起到保護臟器功能的作用。本實驗結(jié)果，膿毒癥大鼠的生存率出現(xiàn)了明顯改善，僅有DEX組96 h仍有生存。而在24 h及48 h雖未有統(tǒng)計學(xué)差異，可能是僅是樣本量較少的原因。使用地塞米松后大鼠一般情況也有明顯改善，大鼠的進食量以及現(xiàn)活動較多，發(fā)熱，寒戰(zhàn)，豎毛情況均有改善。本實驗證實了在膿毒癥發(fā)生早期使用小劑量的地塞米松可以有效的改善膿毒癥的預(yù)后。

肺損傷過度的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的釋放是膿毒癥發(fā)生的最重要的原因[7-8]。大量炎癥因子參與了膿毒癥的過程[9-11]，炎癥因子參與了逐次炎性級鏈反應(yīng)，最終加速了膿毒癥的進程。本次實驗中發(fā)現(xiàn)使用地塞米松干預(yù)后，所檢測的炎癥因子表達水平最終均出現(xiàn)下降。但同時發(fā)現(xiàn)地塞米松干預(yù)后早期炎癥因子水平下降尚不明顯，24 h組出現(xiàn)了明顯的下降。根據(jù)本實驗中地塞米松對于炎癥因子水平表現(xiàn)出廣泛的抑制作用，以及使用地塞米松后大鼠生存率和一般情況的改善，筆者考慮地塞米松可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)水平水平對減輕膿毒癥的損傷。

TNF-α，被認為是膿毒癥病理過程中最重要的炎癥因子，是炎癥刺激下早期的始動炎癥因子。IL6在TNF之后升高，IL-6水平可以作為疾病嚴重程度及死亡率的預(yù)測[12]。在本實驗中地塞米松明顯下調(diào)TNF-α及IL-6，對于IL-6水平調(diào)控較為明顯。

MMP-9是金屬蛋白酶家族中分子質(zhì)量最大的酶，又稱明膠酶B。MMP-9參與細胞外基質(zhì)的破壞和改建。對于膠原和明膠以及纖維連接蛋白，層黏連蛋白等的降解均起到重要作用。當(dāng)炎癥細胞被激活，炎癥因子大量釋放，從而最后促進MMP-9的高水平表達。MMP-9在組織重塑、傷口愈合、炎癥免疫等病理生理過程中均有重要作用[13]。目前有文獻表明MMP-9可能能作為炎癥的早期檢測指標(biāo)[14]，并能作為一個預(yù)示炎癥的發(fā)生的標(biāo)志物[15]。

膿毒癥發(fā)生后炎癥因子的釋放可以被初步分為兩階段：膿毒癥發(fā)生后炎癥因子被激活釋放，炎癥因子在促進全身炎癥的同時，也活化了中性白細胞彈性蛋白酶（NE）和金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs）[16]。在試驗中筆者觀察到地塞米松干預(yù)后12 h炎癥介質(zhì)水平尚無明顯變化，24 h和48 h出現(xiàn)明顯下降，故考慮地塞米松在重度膿毒癥發(fā)生后可能對晚期炎癥介質(zhì)的效果更為明顯。

MMP-9及IL-8均為膿毒癥晚期炎癥因子。已有報道表明MMP-9在膿毒癥開始后裂解活化IL-8[17]。同時IL-8作為一個中性粒細胞趨化因子，而中性粒細胞在活化后又能釋放MMP-9。IL-8同MMP-9可能在膿毒癥過程中已形成正反饋。MMP-9對于IL-8有很強的趨化作用[18]。本實驗中在地塞米松的干預(yù)下MMP-9及IL-8水平均出現(xiàn)了明顯下降，地塞米松調(diào)控晚期炎癥因子的作用可能能有效改善膿毒癥的預(yù)后。

MMP-9對于細胞外基質(zhì)及基底膜親和力高，大量釋放時破壞上皮的完整性破壞，可使蛋白質(zhì)以及體液漏出。引起肺水增多，提高肺干濕重比。但在本實驗中未出現(xiàn)MMP-9同W/D的同步變化。筆者考慮在重度CLP手術(shù)后，嚴重膿毒癥下血管內(nèi)皮細胞完整性遭破壞引起血漿外滲，但實驗中大鼠停止進食飲水導(dǎo)致大鼠處于嚴重的休克狀態(tài)，對照DEX干預(yù)組大鼠一般狀態(tài)較好飲水較多休克狀態(tài)得到一定程度改善。MMP-9破壞基底膜后由于體液量不足，故未出現(xiàn)明顯的肺水腫。

綜上所述，膿毒癥早期小劑量使用地塞米松可以有效的改善膿毒癥的預(yù)后。地塞米松通過抑制炎癥因子改善膿毒癥預(yù)后，地塞米松對于膿毒癥晚期炎癥因子水平MMP-9及IL-8的調(diào)控較TNF-α等早期炎癥因子可能更為重要。這可能對于激素干預(yù)治療提供新的研究方向。但尚需進行進一步的實驗增加樣本數(shù)來證實地塞米松對于生存率的改善。

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