李 陽 孫世光 謝予朋 孫曉迪 閆 薈 石亞飛

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，北京 100700；2.河北北方學院研究生部，河北張家口 075000

徐長卿為蘿藦科多年生草本植物，《太平圣惠方》記載，徐長卿具有化瘀散結，降脂通絡等作用[1]。臨床上用于調節(jié)血脂代謝紊亂，降低血脂、防治心腦血管動脈硬化[2]。攻膜復合物C5b-9的過度活化引發(fā)的內皮細胞損傷是導致動脈粥樣硬化發(fā)生的主要原因[3]，前期實驗研究已確定了導致內皮細胞損傷的C5b-9臨界濃度，即C5b-9的亞溶破劑量，本文旨在研究徐長卿提取物對損傷內皮細胞中炎癥介質活性的調節(jié)作用，探究徐長卿治療動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC（上海青忠貿易有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone公司），補體 C5b-6、C8、C9（德國 Merck 公司），補體 C7（美國 Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細胞介素-8（IL-8）試劑盒（南京建成），徐長卿藥材（購自吉林大藥房），丹皮酚標準品（北京藥品生物制品檢定所），標準酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 徐長卿藥材有效成分提取 稱取徐長卿藥材適量，置于圓底燒瓶中，加入適量50%乙醇溶液，回流提取2 h，待提取液冷卻后二次回流提取1 h，放冷過濾，經冷凍干燥后，得到藥材凍干粉。

1.2.2 內皮細胞損傷模型的建立[4-7]前期應用激光共聚焦顯微技術已確定了導致內皮細胞損傷的C5b-9的臨界濃度，現(xiàn)將該濃度的C5b-9組裝于內皮細胞表面，具體過程如下：用2.5 mg/L的胰蛋白酶消化分離細胞，預熱無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次，1000 r/min，離心 5 min。 加入純品 C5b-6（1.6 mg/L，1 mL）和 C7（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1 h。RPMI 1640洗去未結合的補體成分，加入 C8（10 mg/L，1 mL）和C9（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1.5 h。 RPMI 1640洗去未結合的補體，將組裝好的細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔接種 1.5×104細胞），置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，使細胞穩(wěn)定。

1.2.3 提取物對損傷細胞的作用 分別稱取適量藥材提取物凍干粉及丹皮酚標準品，用PBS緩沖溶液配制成高、中、低濃度溶液，分別用以上藥物處理細胞，同時設立空白對照及模型對照組。處理后細胞置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育96 h，收集細胞培養(yǎng)上清液。

1.2.4 測定上清液中各炎癥介質的活性 按照試劑盒說明書，分別測定收集的上清液中LDH、TNF-α及IL-8的活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據進行分析，計量資料數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

細胞培養(yǎng)上清液中各炎癥介質的分泌水平見表1。由表1可知，徐長卿提取物高劑量組及中劑量組與模型對照組比較，LDH、TNF-α及IL-8分泌水平差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但高劑量組中各炎癥介質的分泌水平與空白對照組水平接近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。丹皮酚標準品對照組與實驗組結果基本一致，其中中劑量組對LDH的調節(jié)作用優(yōu)于高劑量組。

3 討論

早期研究已經證實，徐長卿藥材中的主要成分為丹皮酚，占藥材總量的1%左右[8-9]。前期實驗研究得出50%乙醇提取可最大限度得到有效成分。趙霞等[10]通過研究丹皮酚對高脂血癥大鼠的膽固醇、三酰甘油等血象指標的調節(jié)作用，得知丹皮酚可調節(jié)主動脈組織中脂質過氧化反應的發(fā)生，改善炎癥細胞因子的分泌；有研究指出，丹皮酚能夠抑制細胞內氧自由基的產生[11]，這可能對炎癥環(huán)節(jié)產生影響；戴敏等[12]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可降低動脈粥樣硬化家兔血清中TNF-α含量，抑制兔血管平滑肌細胞的增殖；周曉慧等[13]指出，丹皮酚可抑制NF-κB信號通路，從而介導黏性分子的表達。本實驗以人體血管組織細胞人臍靜脈內皮細胞作為實驗載體，建立內皮細胞損傷模型，藥物干預治療后發(fā)現(xiàn)，徐長卿藥材提取物可顯著降低炎癥因子LDH、TNF-α及IL-8的活性，進而修復內皮細胞損傷，以達到治療動脈粥樣硬化的目的。實驗中設立丹皮酚標準品對照組，得出了與實驗組一致的結果，進一步證實了發(fā)揮主要治療作用的有效成分即為丹皮酚。

表1 各組上清液中各炎癥介質分泌水平（±s）

表1 各組上清液中各炎癥介質分泌水平（±s）

注：與空白對照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型對照組比較，**P ＜0.01；LDH：乳酸脫氫酶；TNF-α：腫瘤壞死因子；IL-8：白細胞介素-8；“-”表示無數(shù)據

空白對照組模型對照組提取物高劑量組中劑量組低劑量組丹皮酚高劑量組中劑量組低劑量組--1.60 0.80 0.40 0.20 0.10 0.05 117.85±1.65 200.49±3.31△△119.85±4.12**165.20±3.51△△**222.78±5.55△△123.53±4.80△**118.58±4.99**161.32±4.81△△**96.00±2.26 108.00±2.30△△94.75±3.19**92.81±1.78△**132.69±1.84△△98.42±0.90**105.56±2.15△△116.12±2.89△△30.88±2.50 40.98±0.60△△33.65±2.48**37.28±0.26△△**43.55±0.64△△31.52±1.20**37.12±1.37△△**37.95±0.97△△**組別 給藥劑量（g/L） LDH（U/L） TNF-α（ng/L） IL-8（ng/L）

內皮細胞損傷發(fā)生后，可產生多種炎癥因子，常見的有LDH、TNF-α、IL-8等，這些炎癥因子可導致血管功能紊亂，阻斷局部血流供應，使組織缺血缺氧壞死，進而加重內皮細胞的損傷程度[14-16]。徐長卿中的主要有效成分丹皮酚可能干預這些炎癥因子的受體表達，以降低其活性，因此今后可從分子水平對該類基因的表達進行更深層次的研究。

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