范存剛，王棟梁，張慶俊，周景儒

(北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京 100044)

隨著干細(xì)胞研究的深入，干細(xì)胞移植有望成為 治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法。雖然已有胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的報道［1，2］，但由于目前存在神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量有限、取材困難，胚胎干細(xì)胞分離純化技術(shù)困難、倫理與法律爭議和形成畸胎瘤的風(fēng)險，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨供者年齡增長出現(xiàn)含量和增殖能力下降的諸多問題［2，3］，因此，尋找可靠而易于獲得的細(xì)胞來源，成為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首要問題。人臍血細(xì)胞具有來源豐富、采集方便、無倫理和法律障礙等優(yōu)點(diǎn)，能在適宜的條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞并修復(fù)神經(jīng)損傷［4］，故有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細(xì)胞來源。然而，體內(nèi)移植后，僅有不足10%的人臍血單個核細(xì)胞(UCB-MNCs)表達(dá)神經(jīng)表型［4］，難以解決動物模型或患者神經(jīng)功能的迅速恢復(fù)問題。2009～2011年，我們檢測了UCB-MNCs、成人外周血單個核細(xì)胞(APB-MNCs)內(nèi)5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平，旨在為闡明UCB-MNCs 修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍血取自我院產(chǎn)科15例足月妊娠、正常分娩產(chǎn)婦的嬰兒臍血，成人外周血取自我院健康查體的12例年齡22～38歲的成人外周血，均在無菌條件下采集。將臍血及外周血貯存于4 ℃冰箱內(nèi)，在6 h 內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞分離。1%牛血清白蛋白購自Sigma 公司;LG-DMEM、胎牛血清和青霉素、鏈霉素均為Gibico 公司產(chǎn)品;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5(NT-4/5)的ELISA 試劑盒分別購自Chemicon 公司和Promega 公司;5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的引物均由上海生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 分離 先將每份血標(biāo)本以含1%牛血清白蛋白的無菌PBS 液按1∶1 比例稀釋，緩慢加入Ficoll-Paque，以800 g 離心25 min;然后于梯度界面收集MNCs，并以PBS 洗滌兩次。先從每份分離的MNCs 中取出2 ×106個細(xì)胞，用于RNA 提取和PCR 檢測。然后將剩余的MNCs以1 ×106個/cm2接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的LG-DMEM 中，于37℃、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)10 d;然后收集培養(yǎng)液上清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

1.2.2 RNA 提取及引物合成 采用Trizol 提取液、按Trizol 使用說明書推薦的方法提取MNCs 中的總RNA，以260 nm 分光光度測定進(jìn)行RNA 定量。逆轉(zhuǎn)錄體系的終體積為40 μL，其中含有2 μL 500 μg/mL的隨機(jī)引物、2 μL 10 mmol/L的dNTP、2 μg 總RNA、16 μL 雙蒸水。逆轉(zhuǎn)錄體系在65 ℃水浴中孵育5 min 后，加入8 μL 5 ×緩沖液、2 μL RNA 酶抑制劑、4 μL 0.1 mol/L的二硫蘇糖醇，37 ℃孵育2 min 后加入2 μL 小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶;37 ℃孵育1.5 h 后放入95 ℃水浴中10 min，再置于冰上5 min，以滅活轉(zhuǎn)錄酶。

5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)參(β-actin)的引物分別為:①膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(400 bp):上游引物:5'-TTATGGGATGTCGTGGCTG-3'，下游引物:5'-TTTCATAGCCCAGACCCAAG-3'。②神經(jīng)生長因子(NGF)(167 bp):上游引物:5'-ATACAGGCGGAACCA CAC-3'，下游引物:5'-GTAATGTTGCG GGTCTGC-3'。③神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)(201 bp):上游引物:5'-TTGCCAGAAGACTCGCTC-3'，下游引物:5'-CAGTTCGGTGTCCATTGC-3'。④NT-5(246 bp):上游引物:5'-TAACGCTGAGGAAGGTGG-3'，下游引物:5'-AGGTCTCTCAGCATCCAG-3'。⑤BDNF(744 bp):上游引物:5'-ATGACCATC CTTTTCCTTAC-3'。下游引物:5'-CTATCTTCCCCTT TTAATGG-3'。⑥β-actin(578 bp):上游引物:5'-AT CTGGCACACCTTCTACA-3'，下游引物:5'-GTTTCGT GGATGATGCAACAGGACT-3'。

1.2.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA 表達(dá)檢測 采用RTPCR 技術(shù)檢測UCB-MNCs、APB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表達(dá)。電泳PCR 擴(kuò)增體系的終體積為50 μL，各種成分的終濃度分別為dNTP 0.25 mmol/L、MgCl22.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶2.5 U/100 mL、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl 緩沖液(pH 8.3)10 mmol/L。BDNF的循環(huán)條件為94 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、45 s;GDNF、NGF、NT-3 和NT-4/5的循環(huán)條件為94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、30 s。PCR 產(chǎn)物在含有EB的2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果在紫外線燈光下觀察，并以數(shù)碼照相系統(tǒng)采集圖片。

1.2.4 BDNF、NT-4/5 分泌檢測 采用ELISA 法檢測UCB-MNCs 和APB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌水平，按照BDNF、NT4/5的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 BNDF 和NT4/5的分泌水平以±s 表示，以t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)結(jié)果 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，UCB-MNCs、APB-MNCs 在培養(yǎng)24 h 時均有部分細(xì)胞懸浮，更換培養(yǎng)液后大部分細(xì)胞開始呈貼壁生長，并呈現(xiàn)圓形、卵圓形、紡錘形等細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)第10 天時，上述細(xì)胞均達(dá)到80%～90%的匯合程度。

2.2 UCB-MNCs、APB-MNCs 中各神經(jīng)營養(yǎng)因子的mRNA 表達(dá) RT-PCR 檢測顯示，UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表達(dá)水平均高于APB-MNCs(見圖1)。

圖1 UCB-MNCs、APB-MNCs 中GDNF、NT-5、NGF、NT-3 和BDNF的mRNA 表達(dá)

2.3 UCB-MNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌差異 ELISA 法檢測顯示，UCBMNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)第10 天時，其培養(yǎng)液上清中的BDNF 分 泌 水 平 分 別 為(827.50± 48.68)、(155.65±56.03)pg/mL，NT4/5 分別為(236.64±7.51)、(60.53±10.81)pg/mL，即UCB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平分別約為APBMNCs的5、4 倍(P 均＜0.01)。

3 討論

近來研究表明，人臍血細(xì)胞能在體內(nèi)外環(huán)境中被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［5］，且能明顯改善腦外傷［6］、腦梗死［7］、脊髓損傷［8］等神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型的神經(jīng)功能。然而，現(xiàn)有的體內(nèi)外研究均難以解釋低比例人臍血細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞如何發(fā)揮明顯的促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，人們推測人臍血細(xì)胞除了通過分化為神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞替代作用之外，其修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制還可能與分泌某些細(xì)胞因子的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)［9］。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是在神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育、生長和成熟神經(jīng)元功能的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)，其中GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5 是研究最廣泛的5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF 是人們發(fā)現(xiàn)的第1種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對交感和感覺神經(jīng)元的存活和維系至關(guān)重要，并可促進(jìn)軸突生長［10］。隨后研究者又發(fā)現(xiàn)，BDNF 具有促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)現(xiàn)有神經(jīng)元存活、促進(jìn)新生神經(jīng)元和軸突生長及分化的作用［11］。NT-3 是人們發(fā)現(xiàn)的第3 種神經(jīng)營養(yǎng)因子，與NT-4/5 分 別 通 過TrkC 和TrkB 受 體 結(jié) 合，發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元存活、增殖及軸突再生的作用［12］。GDNF 是一種能夠促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動神經(jīng)元存活的小分子蛋白，是第1個被發(fā)現(xiàn)并命名的GDNF 家族成員［13］。

本研究顯示，UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-5 mRNA 表達(dá) 水平 均 高 于APBMNCs，UCB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平，分別約為APB-MNCs的5、4 倍。由此我們推測，UCB-MNCs 中的神經(jīng)營養(yǎng)因子高表達(dá)和分泌可能是其修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制之一，將來有必要在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型中對該機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。

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