韓 梅，王慧達，李曉旭，王 卓，魏 冉

(沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院，遼寧沈陽 110866)

磷是植物生長的三大營養(yǎng)元素之一，并且只有可溶性磷能被植物吸收利用。由于在自然條件下磷極易被固定，這極大限制了作物的正常生長。氮和磷是植物生長的重要元素，許多種類微生物對氮、磷等養(yǎng)分的轉化和供給起重要作用［1］。根瘤菌能夠固定空氣中的分子態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)，解磷菌能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可溶狀態(tài)，供植物吸收利用［2］。在自然界中微生物是以混居狀態(tài)存在的，對于它們之間相互關系的了解有助于人類有意識地充分發(fā)揮其互作效應，但由于微生物存在個體微小的特點，對于在共存或混合狀態(tài)下相互之間的關系的研究顯得較為薄弱。多菌株混合培養(yǎng)時各菌之間存在著代謝的協(xié)同作用［3］。各菌之間可能進行直接或間接地相互作用，互相提供所需的營養(yǎng)，轉移或消除抑制產物，或通過一些物理或生化機制刺激彼此間的生理活動［4］。本文通過對實驗室保存的根瘤菌(R12)和解磷菌(S7)進行單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，研究它們之間的互作效應，為復合微生物肥料的開發(fā)利用提供科學根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 大豆根瘤菌R12、磷細菌S7，由沈陽農業(yè)大學微生物學教研室微生物肥料研究組分離和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 根瘤菌采用YMA培養(yǎng)基;解磷菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;解磷量的測定采用Pikovaskaia，s(PKO)培養(yǎng)基［5］;液體混合培養(yǎng)基:甘露醇10.0 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母膏 1.0 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO40.003 g，Rh 溶液 4 mL，CaCO35.0 g，CaCl 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8 ～ 7.0。(Rh 微量元素液:H3BO45.0 g，Na2MO45.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 3.0)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將活化好的R12和S7菌種接入100 mL液體混合培養(yǎng)基，每瓶接入菌種2環(huán)，3次重復，30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，待用。

1.2.2 2菌單獨培養(yǎng)及混合培養(yǎng) 將R12和S7各取2 mL分別接入100 mL PKO培養(yǎng)基，將R12和S7 2菌各取2 mL菌懸液混合接入100 mL PKO培養(yǎng)基，3次重復，并設一不接菌的空白對照，30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，定時取發(fā)酵液。

1.2.3 單獨培養(yǎng)后的除菌上清液制備 取菌懸液離心 10 000 r/min，20 min。

1.2.4 加入另一菌株單獨培養(yǎng)后的除菌上清液培養(yǎng) 取單獨培養(yǎng)后的除菌上清液2 mL加入已接入另一種菌的PKO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3次重復，并作一不接菌的空白對照，30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，定時取發(fā)酵液。

1.2.5 生物量測定 采用稀釋平板計數(shù)。

1.2.6 可溶性磷 采用鉬銻抗比色法測定。

2 結果與分析

2.1 R12和S7混合培養(yǎng)的活菌數(shù)

對R12和S7分別進行單獨及混合培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)的初始階段，R12與S7活菌數(shù)大致相等，培養(yǎng)24 h后，R12逐漸成為混合體系中的優(yōu)勢菌種，培養(yǎng)36 h，兩者分別占總數(shù)的91.3%和8.7%。與單獨培養(yǎng)相比，S7活菌數(shù)變化幅度較小，R12的數(shù)量變化幅度較大，明顯多于單獨培養(yǎng)(圖1)。

2.2 S7對R12生長的影響

R12與S7混合接種和加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液混合培養(yǎng)與其單獨培養(yǎng)相比，R12均提前進入對數(shù)期，單獨培養(yǎng)在第48 h活菌數(shù)達到最大值，而在與S7混合培養(yǎng)和加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液條件下在36 h就達到了最大值，活菌數(shù)達到最大值均提前12 h;在對數(shù)期與單獨培養(yǎng)相比較，混合培養(yǎng)活菌數(shù)高出38.2%，加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液高出45.8%。與混合培養(yǎng)相比，R12在加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的活菌數(shù)增幅更為明顯，比混合培養(yǎng)高出12.3%(圖1)。R12混合培養(yǎng)和加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液比單獨培養(yǎng)的活菌數(shù)表現(xiàn)出明顯的增加。

2.3 R12對S7生長的影響

S7在單獨培養(yǎng)，混合培養(yǎng)，加R12單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的條件下，活菌數(shù)變化不大，都在第60 h達到最大值，加入R12單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的處理比單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的活菌數(shù)增加了7.5%和12.1%。單獨培養(yǎng)比混合培養(yǎng)活菌數(shù)高出5%?？赡苁怯捎赗12的生長繁殖消耗和占據(jù)了一定的營養(yǎng)和空間，使得S7的生長繁殖受到一定的限制，而比只加R12無菌單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的情況下少。

2.4 R12對S7解磷能力的影響

由圖2可以看出，不同時期，混合培養(yǎng)和加入R12無菌單獨培養(yǎng)后的除菌上清液2個處理都比S7單獨培養(yǎng)時的解磷量高，3個處理都在第10天達到最大值，說明S7在第10天的解磷能力最強，混合培養(yǎng)和加入R12無菌單獨培養(yǎng)后的除菌上清液較單獨培養(yǎng)時的解磷量分別增加了23.6%和27.8%，且加入R12無菌單獨培養(yǎng)后的除菌上清液較混合培養(yǎng)高5.6%。培養(yǎng)到第15天時，各個處理的溶磷能力開始下降，但是在第22天時，有所回升。這可能是發(fā)酵液中菌體的死亡率增加，細胞破裂，又將細胞內可溶性磷釋放出來，導致發(fā)酵液中可溶性磷的濃度增加。

圖1 S7、R12單獨培養(yǎng)、混合培養(yǎng)及加彼此上清液的活菌數(shù)對比Fig.1 The contrast of viable count of S7and R12 cultured alone respectly、mixed cultured and witheach other＇Sterile supernatant

圖2 不同處理條件下S7的解磷量對比Fig.2 The contrast of solubilizing of S7 under different conditions

3 討論

研究結果表明，在混合培養(yǎng)中，R12和S7，與單獨培養(yǎng)相比，兩者的生物量都有不同程度的提高。原因可能是二者的某些代謝產物對彼此有一些促進作用。從試驗結果推測，R12與S7可能存在互利共生關系，二者混合培養(yǎng)時可能進行直接或間接地相互作用，互相提供所需的營養(yǎng)，轉移或消除抑制產物，或通過一些物理或生化機制刺激彼此間的生理活動。

在加入S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的處理中，R12的生物量表現(xiàn)為比單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)多。這說明在加入的S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液對R12有一定的促進作用。進而說明S7生長繁殖過程中分泌的某些代謝產物對R12的生長繁殖有促進作用，而加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液比混合培養(yǎng)多的原因可能是混合培養(yǎng)下S7的生長過程需要占用一部分營養(yǎng)和空間，使得R12在混合培養(yǎng)條件下比加S7單獨培養(yǎng)后的除菌上清液條件下活菌數(shù)偏少。在加入R12單獨培養(yǎng)后的除菌上清液處理中S7的生物量也比單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)多。這說明加入R12的單獨培養(yǎng)后的除菌上清液對S7有一定的促進作用。同樣說明R12的代謝產物對S7也有促進作用。

在對解磷能力的研究中，本試驗不同處理的條件下可溶性磷的濃度都在第10天達到最大值，說明這時的解磷能力最強。王富明等［6］研究表明，磷細菌和固氮菌聯(lián)合生長時，對發(fā)揮磷細菌的解磷作用十分有利，有助于土壤中水溶性磷的形成。試驗表明混合培養(yǎng)和加無菌單獨培養(yǎng)后的除菌上清液都比單獨培養(yǎng)表現(xiàn)出較強的解磷能力。在解磷能力達到最強時，混合培養(yǎng)和加入單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的S7生物量和單獨培養(yǎng)相比沒有太大變化，但是發(fā)酵液中的水溶性磷的濃度卻比單獨培養(yǎng)高，說明S7單菌的解磷能力提高了。原因可能是混合培養(yǎng)和加入單獨培養(yǎng)后的除菌上清液的發(fā)酵液中某些代謝物質促進了解磷菌的解磷作用。同時磷是微生物生長繁殖的必需營養(yǎng)元素之一，混合培養(yǎng)過程中，將消耗一部分可溶性磷構建微生物細胞［7］，所以解磷菌的解磷能力可能更高。

［1］ 孫焱鑫，姚軍刑，禮軍.解鉀菌與解磷菌及固氮菌的相互作用［J］.生態(tài)學雜志，2001，21(2):71-73.

［2］ 王光華，趙英，周德瑞，等.解磷菌的研究現(xiàn)狀與展望［J］.生態(tài)環(huán)境，2003，12(1):96.

［3］ 丘元盛，周淑萍，莫小真，等.稻根聯(lián)合固氮菌的研究Ⅰ:菌種的分離［J］.微生物學報，1981，21(4):468-472.

［4］ Holguin G，Bashan Y.Nitrogen fixing by Azospirillum brasilense Cd is provided when co-culture with a mangrove rhizosphere bacteria［J］.Soil Biol.Biochem，1996，28(12):1651-1660.

［5］ 馮瑞章，姚拓，周萬海，等.溶磷菌和固氮菌溶解磷礦粉時的互作效應［J］.生態(tài)學報，2006，26(8):2764-2769.

［6］ 王富明，張彥，吳皓瓊.解磷固氮菌劑的研制及其對小麥增產效應［J］.生物技術，1994，4(4):15-18.

［7］ 林啟美，王華，趙小蓉，等.一些細菌和真菌的解磷能力及其機理初探［J］.微生物學通報，2001，28(2):26-30.