鄧 黎，韓 濤，王曉虹，皮 立，韓 發(fā)

中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008

蛹蟲草［C.militarisc(L).Link］又名北冬蟲夏草。屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲草屬，世界上已發(fā)現(xiàn)蟲草屬真菌350多種，我國記錄61種［1］。蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸(甘露醇)、蟲草多糖、維生素、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、多種微量元素等化學成分［2-4］。

蟲草酸即甘露醇，又稱 D-甘露糖醇，分子式C6H14O6，分子量182.17，是蟲草的重要活性成分之一［5］。隨著對蟲草酸作用機理的認識不斷深入，其臨床用途越來越廣泛，蟲草酸已經(jīng)應用于治療顱內(nèi)疾病、頑固心絞痛、消化系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、眼科疾病、頑固性超高熱以及中毒時導瀉等［6，7］。由于甘露醇的化學穩(wěn)定性好，具甜味又不吸濕性，廣泛用于抗癌藥及維生素藥片的賦形劑，也用于醒酒藥和清涼劑等配方［8］，顯示了蟲草酸在醫(yī)學領域具有廣闊的應用空間。從蛹蟲草中直接分離提取得到蟲草酸并進一步應用于藥劑、保健品等可為蛹蟲草在有效活性成分方面的應用提供更廣泛的空間，保證蟲草酸來源的優(yōu)質(zhì)和可靠性。

近年來，研究人員對蟲草酸的提取進行了工藝改進和優(yōu)化，但是所得到的優(yōu)化工藝均是在單因素或正交試驗條件下獲得的。響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可檢查一個或多個響應變量與一系列試驗變量之間的關系，確定試驗因素及其交互作用在工藝過程中對指標響應值的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系［9］。因此，將響應面分析的方法應用于人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體中蟲草酸微波提取工藝的研究，建立得率與考察因素之間關系的數(shù)學模型，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術參數(shù)和理論依據(jù)是有必要的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;METTLER TOLEDO PL203和XS204電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司;P 70 D 17 TLD5微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，布氏抽濾漏斗，Lary 300紫外分光光度儀(美國);DHG-9070 A型電熱恒溫故風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

人工培養(yǎng)蛹蟲草CSM-8菌株由西寧世峰生物科技有限公司提供。樣品經(jīng)微波干燥后，粉碎、過60目篩，加入無水乙醇脫脂。甘露醇對照品由國家標準物質(zhì)研究中心提供。實驗所用化學試劑均為分析純。實驗用水均為蒸餾水。

1.2 蛹蟲草子實體中蟲草酸分析測定方法

1.2.1 蛹蟲草子實體中蟲草酸的提取及測定

用天平準確稱取干燥后的子實體粉末1.00 g，加入適量的超純水后超聲提取、離心、抽濾，濃縮后定容至10 mL，靜置，得到待測液。

比色法測定蟲草酸含量。取待測溶液1.00 mL加入1.00 mL高碘酸鉀溶液混勻，室溫放置10 min，加2.00 mL 0.1%L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鉀，混勻后加4 mL新鮮配制的NaSh試劑(150 g醋酸銨+2.00 mL冰醋酸+2.00 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋至1000 mL)，53℃水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，在分光光度儀415 nm處，以蒸餾水作空白對照，測定吸光度值。

標準曲線:精確稱取干燥至恒重的甘露醇標準品50 mg，加蒸餾水50 mL配制成濃度1 mg/mL的蟲草酸溶液，依次稀釋，得系列濃度標準品溶液。按蟲草酸含量測定方法操作，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制甘露醇標準曲線，得Y=0.008X+0.0203，R2=0.9995，表明甘露醇在 10 ～ 50 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性。

1.2.2 蟲草酸含量和提取率計算

蟲草酸含量(%) = (被測液中蟲草酸的濃度×待測液總體積) ÷稱取的子實體質(zhì)量

蟲草酸提取率(%) = 被測液中蟲草酸含量÷子實體樣品中蟲草酸含量(已有試驗中測定得到微波干燥方法下子實體中的蟲草酸含量為6.74%)

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

主要考察微波時間、微波功率、液料比以及提取次數(shù)對人工蛹蟲草子實體中蟲草酸提取率的影響。按照1.2.1方法提取蟲草酸，并計算提取率。

1.3.1.1 微波時間對蟲草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察 2、3、4、5、6 min 對蟲草酸提取率的影響。

1.3.1.2 微波功率對蟲草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察微波為200、400、500、600、700 W對蟲草酸提取率的影響。

1.3.1.3 液固比對蟲草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察液固比20、30、40、50和60 mL/g對蟲草酸提取率的影響。

1.3.1.4 提取次數(shù)對蟲草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察提取次數(shù)為1、2、3次對蟲草酸提取率的影響。

1.3.2 響應曲面法試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對響應值(蟲草酸提取率)有顯著影響的因素，利用Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進行編碼，模型選用二次方程Y=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β12x1x2+β13x1x3+β23x2x3+。

其中 Y 為響應值(蟲草素提取率)，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33為方程系數(shù)，x1、x2、x3為自變量編碼值。通過Box-Behnken設計和響應面分析來進一步考察提取時間、微波功率和液固比之間的相互影響，并確定微波法提取蟲草酸的最佳工藝參數(shù)。

1.3.3 優(yōu)化工藝驗證試驗

按照響應曲面法確定的最佳提取工藝參數(shù)，對100 g CSM-8菌株子實體粉末進行微波提取，取500 mL提取液濃縮成濃膏狀，烘干，測定提取液中固形物和蟲草酸的含量，并計算蟲草酸的提取率。測定結(jié)束后將固形物重新用蒸餾水溶解并定容到500 mL，放回到提取液中。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對蟲草酸提取率的影響

由圖1見，在2～4 min內(nèi)，蟲草酸提取率隨提取時間的延長提高比較明顯，4 min后開始下降。因此設定提取時間為3～5 min。

圖1 提取時間對蟲草酸提取率的影響Fig.1 Effect of extraction duration on cordyceps acid yield

2.1.2 微波功率對蟲草酸提取率的影響

由圖2見，在微波時間4 min內(nèi)，隨著功率的增加，蛹蟲草多糖的提取率逐漸升高，在功率達到500 W之后，蟲草酸的提取率變化不大，表明基本提取完全。因此設定微波功率為400～600 W。

圖2 微波功率對蟲草酸提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on cordyceps acid yield

2.1.3 液固比對蟲草酸提取率的影響

從圖3見，隨液固比的增大，蟲草多糖的提取率不斷升高，在液固比為20～40 mL/g時迅速升高，在50 mL/g時達到最大值，在50 mL/g以后提取率無明顯增加，呈穩(wěn)定趨勢。因此，微波輔助提取法提取蟲草多糖的液固比確定為30～50 mL/g。

圖3 液固比對蟲草酸提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on cordyceps acid yield

2.1.4 提取次數(shù)對蟲草酸提取率的影響

在液固比50 mL/g、微波功率500 W、提取時間4 min的條件下，考察提取次數(shù)對蟲草多糖提取率的影響，實驗結(jié)果見圖4，第一次提取率為35.92%，第二次提取后累計達48.00%(相對一次提取的結(jié)果增加比較顯著)，提取3次累計的提取率為48.01%，與提取2次的提取率間無差異。結(jié)合經(jīng)濟成本核算考慮以提取2次為宜。

圖4 提取次數(shù)對蟲草酸提取率的影響Fig.4 Effect of times of extraction on cordyceps acid yield

2.2 響應曲面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應曲面法分析因素的選取及分析方案

在單因素實驗的基礎上固定提取次數(shù)為3次，采用Box-Behnken設計方案，分別以微波功率、提取時間和液固比對應3個獨立變量X1、X2、X3，并以-1、0、1分別代表變量的水平。

對自變量進行編碼(表1)。式中xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實值，X0為實驗中心點變量的真實值，ΔX為單變量增量，蟲草酸提取率Y為響應值，實驗方案及結(jié)果見表1和2。

2.2.2 實驗結(jié)果分析

Box-Behnken設計方案及蟲草酸提取率的測定結(jié)果見表2。利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程為:

對回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表3。由表3得出:模型的P＜0.0001，表明模型極顯著且失擬項不顯著(P=0.3125＞0.05)，相關系數(shù)R2=0.9962，說明模型擬合程度很好。模型的調(diào)整確定系數(shù)AdjR2=0.9914，說明該模型能解釋99.14%的響應值的變化，可以用此模型對微波提取CSM-8菌株子實體中蟲草酸提取率進行分析及預測。

模型回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗如下:一次項A(P ＜0.0001)、B(P ＜0.0001)，二次項 A2(P ＜0.0001)、B2(P ＜0.0001)、C2(P ＜0.0001)均達到極顯著水平，一次項C(P=0.0014 ＜0.01)達到顯著水平，表明微波功率、提取時間、液固比對蟲草酸提取率有顯著影響;二次項 AB(P=0.0052＜0.01)、AC(P=0.0011 ＜0.01)、BC(P=0.0003＜0.001)，表明微波功率與提取時間、微波功率與液固比以及提取時間與液固比的交互作用對蟲草酸提取率的影響顯著。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of variable chose for Box-Behnken design

利用Design Expert 7.0.0軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖5、6和7。

由圖5可看出，提取時間和微波功率的交互作用對蟲草酸提取的影響較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，響應值隨微波功率的變化率大于隨提取時間的變化率，說明微波功率對提取率的影響大于提取時間;液固比固定時，蟲草酸提取率隨微波功率的增大而升高，當微波功率達到550 W后，提取率增長緩慢并趨于平緩;蟲草酸提取率水提取時間的延長先升高后降低，呈拋物線趨勢。由圖6可看出，微波功率和液固比的交互作用對蟲草酸提取率的影響較顯著;響應值隨微波功率的變化率大于液固比，說明微波功率對蟲草酸提取率的影響大于液固比;蟲草酸提取率隨液固比的增長而緩慢增長，當液固比為40～50 mL/g時，蟲草酸提取率基本沒有變化。由圖7可看出，液固比和提取時間的交互作用對蟲草提取率的影響極顯著，表現(xiàn)為曲面較陡;響應值隨提取時間的變化率大于液固比，說明提取時間對蟲草酸提取率的影響大于液固比;蟲草酸提取率隨液固比和提取時間的增大而增大，并慢慢趨于平緩。

表2 Box-Behnken設計方案及蟲草酸提取率的測定值Table 2 Box-Behnken design and the responses of the total cordyceps acid yield

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA analysis for response surface quadratic model

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，-P ＞0.05

利用Design Expert 7.0.0軟件對回歸模型進行進一步的典型性分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為:微波功率555 W，液固比35 mL/g，提取時間4 min，提取2次，蟲草酸提取率的理論值可達84.45%。

圖5 微波功率和提取時間影響蟲草酸提取率的等值線與響應面Fig.5 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:microwave power;X2:extraction duration)on the response Y

圖6 微波功率和液固比影響蟲草酸提取率的等值線與響應面Fig.6 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:microwave power;X3:solventmaterial ratio)on the response Y

圖7 提取時間和液固比影響蟲草酸提取率的等值線與響應面Fig.7 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction duration;X3:solvent-material ratio)on the response Y

2.3 驗證實驗結(jié)果

最優(yōu)工藝條件的驗證實驗結(jié)果如表4所示，3次重復實驗的平均值為85.77%，略高于預測值，RSD=0.67%，表明二次多項式建立的數(shù)學模型具有良好的預測性，所選工藝條件重現(xiàn)性好。

表4 驗證實驗結(jié)果(n=3)Table 4 Verification of optimal extraction conditions for the total cordycepic acid yield

3 結(jié)論

本研究根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗設計原理，應用響應面分析方法優(yōu)化提取時間、微波功率和液固比對人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體中蟲草酸微波提取的工藝條件。結(jié)果表明，微波提取人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體中蟲草酸的最佳工藝條件為微波功率555 W，液固比35 mL/g，提取時間4 min，提取2次，蟲草酸提取率的理論值可達84.45%。

1 Liang ZQ(梁宗琦).A corroboration of the anamorph of Cordyceps militaris-Paecilomyces militaris Liang sp.nov..Acta Edulis Fungi(食用菌學報)，2001，8(4):28-32.

2 Wang JF(王建芳)，Yang CQ(楊春清).Summary on effective constituent and pharmacological action of Cordyceps cicadae.Inf Tradit Chin Med(中醫(yī)藥信息)，2005，22(5):30-32.

3 Zhang ZJ(張志軍).Study on new type effective ingredients of cultured Cordyceps militaris SY-(12).Qingdao:Ocean U-niversity of China(中國海洋大學)，MSc.2007.

4 Cai YH(蔡友華)，F(xiàn)an WX(范文霞)，Liu XM(劉學銘)，et al.Determination of cordycepic acid content in the mycelia of Cordyceps brasiliensis Henn by colorimetry.Mod Food Sci Technol(現(xiàn)代食品科技)，2008，25:76-79.

5 Zhu MW(朱明偉)，Wen L(溫魯)，Wei P(魏鵬)，et al.Effect of different liquid culture media on the contents of polysaccharide and cordycepic acid in Cordyceps militaris.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學)，2008，36:573-574，596.

6 Gu ZY(顧振宇)，Wu XM(吳雪美)，Zhang H(張虹).Determination of cordycepin and cordycep acid in Cordyceps sinensis by high-performance liquid chromatography.J Chin Inst Food Sci Technol(中國食品學報)，2007，7:144-148.

7 Lei BX(雷幫星)，Gao HB(高海波)，Shui XB(稅小波)，et al.Determination of mannitol in fermented myceliaof Cordyceps gummii.J Fungal Res(菌物研究)，2004，2:40-44.

8 Sun CX(孫成秀)，Liao JL(廖記錄)，Long XH(龍小慧)，et al.New clinical uses of mannitol.New Med(新醫(yī)學)，1996，27:41-42.

9 Wang YF(王永菲)，Wang CG(王成國).The application of response surface methodology.J Minzu Univ China，Nat Sci Edn(中央民族大學學報，自科版)，2005，14:236-240.