王慶忠，王東方，劉慧蓮，馮道俊，王漢海，郭祖寶

濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院山東省高校“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濰坊 261061

精子發(fā)生是指從原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCSs)增殖、遷移、分化，一直到發(fā)育為成熟精子的整個(gè)過(guò)程［1，2］。這一過(guò)程受到遺傳、激素、生長(zhǎng)因子和環(huán)境等多種因素的影響［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球15%的不育人口中，男性不育占50%［4］，70%不育男子的精子常有缺失、稀少、無(wú)活力、形態(tài)異常等缺陷，但關(guān)于引起這些異常的分子機(jī)理的研究還較少［5］，導(dǎo)致治療男性不育的困難。白消安(busulfan)對(duì)精子發(fā)生有損害作用，導(dǎo)致無(wú)精子癥或少精子癥。利用白消安制備生精障礙模型動(dòng)物，已有大量的報(bào)道［6］。研究顯示，在少精子癥的治療中，單純的西藥治療效果并不及一些中藥方劑［7，8］。在本研究中，我們根據(jù)報(bào)道的生精沖劑協(xié)定配方［8］，研究其對(duì)生精障礙模型大鼠精子發(fā)生的影響和作用機(jī)理，以便更好的利用中藥資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK-京2002-0003。大鼠在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)適應(yīng)后，取5～6周幼年雄性大鼠30只隨機(jī)分為正常組、藥物組和對(duì)照組，每組各10只，體重190±20 g。

1.1.2 主要藥品及試劑

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、多聚甲醛、Tween-20、Triton X-100、DABCO是triethylendianine公司產(chǎn)品;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、白消安等購(gòu)自 Sigma公司。無(wú)菌生理鹽水為北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。大鼠促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)試劑盒、大鼠黃體生成素(luteinizing hormone，LH)ELISA檢測(cè)試劑盒和大鼠睪酮(testosterone，T)ELISA檢測(cè)試劑盒是生研(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自Promega公司;TRIzol試劑購(gòu)自 Gibco公司，superscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶是 Invitrogen公司產(chǎn)品，Tag DNA聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品。生精沖劑協(xié)定處方中的中藥紫河車、黃芪、枸杞子、菟絲子、仙靈脾、龜甲、砂仁、丹參購(gòu)于同仁堂藥店。中藥在常溫下清洗后，70℃下4 h烘干，混合研磨成粉，過(guò)200目篩，包裝后經(jīng)Co60輻射滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物處理

正常組的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。藥物組和對(duì)照組大鼠先制備成生精障礙大鼠，每只大鼠腹腔注射40 mg/kg體重白消安(白消安先以DMSO溶解后，注射前加等量的蒸餾水配制成4.0 mg/mL的濃度，并加溫至35～40 ℃)［9］，1 次/周 ×2。處理 4 ～5 周后，內(nèi)源性精子發(fā)生已經(jīng)基本消除。此后，藥物組的大鼠給予灌胃生精沖劑16 g/kg·d［8］，對(duì)照組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)30 d。

1.2.2 性激素水平的ELISA測(cè)定

停藥后次日，斷頭處死大鼠取血，1500 rpm離心血液分離血清，用ELISA試劑盒測(cè)血清中FSH、LH和T水平。測(cè)定過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟為:①在酶標(biāo)包埋板上，分別設(shè)空白孔(不加樣品和酶標(biāo)試劑)、標(biāo)準(zhǔn)孔(加50 μL標(biāo)準(zhǔn)品)和樣品孔(加40 μL樣品稀釋液和10 μL待測(cè)樣品)，用封板膜封閉后，37℃瘟育30 min;②去封板膜，棄液體，用1∶30稀釋的洗滌液30 s×5次，涼干;③加50 μL酶標(biāo)試劑(空白孔除外)，37℃瘟育30 min;④用1∶30稀釋的洗滌液30 s×5次，涼干;⑤加50 μL顯色劑A，再加50 μL顯色劑B，震蕩混勻，37℃避光顯色15 min;⑥加50 μL終止液，孵育15 min后，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值;⑦以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)樣品的OD值查出相應(yīng)的濃度。

1.2.3 睪丸組織切片與染色觀察

隨機(jī)取各組大鼠左側(cè)睪丸5只，去睪丸白膜，用Bouin's固定液固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察生精小管形態(tài)和精子發(fā)生狀態(tài)。

1.2.4 基因表達(dá)的半定量RT-PCR分析

用TRIzol試劑按說(shuō)明書(shū)提供的方法提取總RNA。用SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，用Tag DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。所檢測(cè)基因是膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)，引物序列為:gdnf(s):5’-GTCGCTAGCATGGGATTCGGGCC-3’;gdnf(a):5’-GAGAAGCTT TCAGATACATCCACACCGTTT-3’(218bp)。G3PDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參照，G3PDH(s):ACCACAGTCCATGCCCATCAC，G3PDH(a):TCCACCACCCTGTTGCTGTA(450bp)。引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±S表示，數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以O(shè)ne-way ANOVA評(píng)價(jià)組間差異。P＜0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生精沖劑處理提高了大鼠血清FSH、LH和T水平

ELISA測(cè)定結(jié)果表明，藥物組大鼠血清中FSH、LH和T水平與正常組相比略低，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與對(duì)照組相比明顯升高，且差異顯著(P＜0.05)(表 1)。

2.2 睪丸組織切片顯示生精沖劑促進(jìn)了精子發(fā)生過(guò)程

在光鏡下觀察各組大鼠的睪丸組織切片，發(fā)現(xiàn)正常組大鼠的曲細(xì)精管完整，較厚，生精細(xì)胞層數(shù)多，排列規(guī)則，各級(jí)生精上皮細(xì)胞層次明顯，曲細(xì)精管管腔中有長(zhǎng)形精子;藥物組大鼠的曲細(xì)精管壁較溥，細(xì)胞排列不規(guī)則，有分化的精原細(xì)胞，管腔中沒(méi)有長(zhǎng)形精子;對(duì)照組大鼠的曲細(xì)精管不完整，生精細(xì)胞少，觀察不到明顯分化的精原細(xì)胞。

表1 血清FSH、LH、T的ELISA測(cè)定結(jié)果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

表1 血清FSH、LH、T的ELISA測(cè)定結(jié)果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

注:與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P﹤0.05);#表示差異不顯著(P﹥0.05)。Note:Compare with control，*represents the difference was remarkable(P ＜0.05);#represents the difference was not remarkable(P ＞0.05).

組別Group FSH level(pg/mL)LH level(pg/mL)T level(ng/mL)正常組 Normal Group 1682.76 ±13.37 1786.36 ±3.45 2.8.046 ±0.29 9 ±0.53藥物組 Drug Group 1676.28 ±11.71*# 1772.15 ±6.46*# 2.73 ±0.31*#對(duì)照組 Control Group 1392.94 ±21.58 1296.25 ±12.49 2

圖1 睪丸組織切片的HE染色圖(×200)Fig.1 Tissue slice of the testis tissue by HE staining(×200)

圖2 不同處理大鼠睪丸組織中的GDNF基因的表達(dá)Fig.2 The expressions of GNDF in different treatment rat testis analyzed by semi-qualitative RT-PCR

2.3 RT-PCR結(jié)果表明生精沖劑促進(jìn)了GDNF表達(dá)

GDNF是促進(jìn)精原干細(xì)胞自我更新、生精細(xì)胞增殖和睪丸支持細(xì)胞增殖的重要生長(zhǎng)因子［9］。對(duì)正常組、藥物組和對(duì)照組的大鼠睪丸組織中的GDNF基因表達(dá)的半定量RT-PCR分析結(jié)繩表明，藥物組與正常組無(wú)明顯差異，與對(duì)照組相比差異顯著。在灌飼生精沖劑1個(gè)月后，睪丸支持細(xì)胞所分泌的GDNF水平與正常大鼠相近，而對(duì)照組的大鼠睪丸中的GDNF表達(dá)水平較弱(圖2)。

3 結(jié)論與討論

白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸酯)主要用于治療慢性粒細(xì)胞白血病，還能引起精原干細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞的大量凋亡，抑制精原干細(xì)胞的自我更新，對(duì)睪丸支持細(xì)胞促凋亡作用相對(duì)較弱，從而造成精子發(fā)生障礙，常用于制備生精障礙動(dòng)物。一般情況下，這種生精障礙在處理后60～90 d時(shí)自然恢復(fù)［4，6］。生精沖劑的協(xié)定配方以補(bǔ)腎填精壯陽(yáng)為主，對(duì)少精無(wú)精子癥患者有一定療效。本研究結(jié)果表明，生精沖劑能提高血清中FSH、LH和T水平，促進(jìn)精子發(fā)生過(guò)程，這種促進(jìn)作用的可能的機(jī)制之一是促進(jìn)了GDNF的表達(dá)。

FSH主要作用于睪丸支持細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分泌多種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子是生精細(xì)胞增殖與分化所必需的。LH主要作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分泌睪酮等。睪酮是促進(jìn)生精細(xì)胞分化的主要激素。在生精障礙模型大鼠睪丸中，由于絕大部分的精原干細(xì)胞和全部分化的生精細(xì)胞被去除，生精作用的恢復(fù)源于少量的精原干細(xì)胞。因此，睪丸支持細(xì)胞分泌的GDNF作用尤其重要。由于生精沖劑提高了FSH水平，促進(jìn)了支持細(xì)胞的增殖和分泌活動(dòng)，GDNF的表達(dá)量增加，從而促進(jìn)了精原干細(xì)胞的增殖;LH水平的升高和T水平的升高是正相關(guān)的，也正是由天T的分泌增多，促進(jìn)了精原干細(xì)胞的分化發(fā)育，導(dǎo)致精子發(fā)生過(guò)程的恢復(fù)加快。但是，睪丸支持細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子種類多，作用復(fù)雜，性激素水平的升高對(duì)其他生長(zhǎng)因子的作用我們沒(méi)有涉及，還有待于進(jìn)一步的研究。

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